电刺激诱导的π-π堆叠作用促进了污泥的腐殖化，增强了种间电子转移和甲烷生成过程

《Water Research》：Electrical Stimulation-Induced π-π Stacking Drives Sludge Humification to Enhance Direct Interspecies Electron Transfer and Methanogenesis

厌氧消化中电刺激通过极化促进污泥腐殖酸（HA）的π-π堆积，形成导电网络，降低电荷转移电阻56%，显著提升甲烷生成效率（+42%）和HA含量（+75.1%），并首次证实13C同位素示踪与电导率增强的DIET途径相关性。

　　

王璐军|姜志豪|于启林|张耀斌

教育部工业生态与环境工程重点实验室（大连理工大学），大连理工大学环境科学与技术学院，中国大连116024

摘要

电刺激已被用于增强厌氧消化（AD）过程，但其潜在机制仍不明确。本研究揭示，电刺激通过促进腐殖质前体的π-π堆叠来加速污泥的腐殖化过程，从而提高电活性和甲烷生成能力。具体而言，与对照组（无电刺激）相比，甲烷生成潜力增加了42%，腐殖酸（HA）含量增加了75.1%。X射线光电子能谱（XPS）分析显示，电刺激组中的π-π堆叠相互作用增强。密度泛函理论（DFT）计算证实，电场导致腐殖质前体发生强极化（偶极矩约为21 Debye）。这种极化显著增强了分子间的非共价相互作用（结合能降低了25.63 kcal/mol），成为π-π堆叠的热力学驱动力。因此，这种超分子组装形成了一个广泛的离域电子系统，使电荷转移阻力降低了56%，促进了直接种间电子转移（DIET）。此外，首次通过13C同位素追踪证实了导电性与DIET贡献之间存在强相关性（R2>0.88）。本研究的结果为理解和优化生物电化学系统提供了新的视角。

引言

厌氧消化（AD）是一种将有机物转化为生物能源（即甲烷）的可持续技术（Rawoof等人，2021年；Wang等人，2024年；Yang等人，2023年）。传统上，这一过程被认为是依赖于种间氢转移（IHT）的共生关系，其中发酵细菌产生H?，随后被H?消耗型微生物（如氢营养型甲烷菌）利用（Huang等人，2025年；Wang等人，2023年；Xu等人，2024年）。然而，IHT需要维持较低的H?分压（<10?? atm），以确保甲烷生成反应（CO? + 4H? → CH? + 2H?O）在热力学上是有利的（Cao等人，2025年；Tezel等人，2011年）。另一种途径是通过外电子细菌（例如Geobacter）和电子营养型甲烷菌（例如Methanothrix或Methanosarcina）之间的电子交换实现甲烷生成，这种电子交换通过导电菌毛或细胞色素C作为电子桥梁（James等人，2025年；Rotaru等人，2014年；Viggi等人，2014年）。

如果在传统的AD系统中建立基于DIET的途径，就可以形成结合IHT和DIET的“双途径”甲烷生成机制，从而提高AD性能。然而，由于污泥的电惰性和缺乏足够的电活性微生物，人们普遍认为在AD系统中建立DIET是具有挑战性的（Li等人，2021年；Wang等人，2021年）。已有大量研究表明，在AD系统中添加导电材料（如生物炭和磁铁矿）作为电子桥梁可以提高污泥的导电性，从而有助于建立DIET（Yang等人，2025年）。然而，这些材料的实际应用受到复杂操作和高成本的限制。

将电极整合到AD系统中可以通过富集电活性微生物和提高污泥导电性来增强AD过程（Logan等人，2019年；Wang等人，2024年；Xie等人，2015年）。Yu等人将污泥导电性的提高归因于电场作用下污泥蛋白质中酰胺基团的极化（Yu等人，2023年；Yu和Zhang，2019年）。然而，这一假设可能无法完全解释长期运行过程中污泥导电性的持续增强，因为污泥蛋白质可能在AD过程中逐渐分解（Ye等人，2018年）。另一方面，理论上认为污泥导电性的提高可以增强微生物间的电子转移，但这仅是一种推测，尚未得到验证。

腐殖质（HS）是通过微生物对有机物的分解和聚合形成的复杂有机大分子（GRANT，1977年；WILSON等人，1978年）。在有氧环境中，例如堆肥过程中，腐殖化相对高效。木质素首先被微生物分解产生多酚化合物，这些化合物在氧气存在下进一步氧化成醌中间体（Vecchio和Blough，2004年）。这些醌化合物随后与含氮化合物发生缩合和聚合反应，最终形成腐殖质（Du等人，2025年；Gao等人，2022年；Sutton和Sposito，2005年）。相比之下，在完全厌氧条件下，由于缺乏氧气，腐殖化过程较为困难。厌氧微生物主要通过脱甲基作用攻击木质素的侧链，将其转化为酚类单体（Carmona等人，2009年；Phelps和Young，1997年）（例如香草酸和对羟基苯甲酸）。然而，由于缺乏有效的氧化缩合条件，这些单体的聚合过程效率较低。据报道，AD过程中产生的酚酸、氨基酸和多糖可以通过氢键、π-π堆叠和金属配位等非共价作用形成腐殖质（Lehmann和Kleber，2015年；Piccolo，2001年）。然而，由于厌氧腐殖化的效率较低，这一形成过程及其潜在机制长期以来被忽视。

HS在AD中的潜在作用既有积极的一面也有消极的一面。有机物的过度腐殖化可能会降低甲烷产量，因为HS对水解酸化酶和游离有机物的吸附会抑制水解和甲烷生成，同时其生物利用率较低（Li等人，2019年；Wang等人，2023年）。另一方面，HS富含氧化还原活性官能团，如醌和酚羟基，这些官能团被认为可以促进电活性微生物间的电子交换，从而可能提高基于DIET的甲烷生成（Lovley等人，1996年；Roden等人，2010年）。然而，以往的研究主要集中在外源性HS或其模型化合物（如AQDS）的影响上，而忽略了厌氧系统中HS的原位形成对甲烷生成的作用。

假设电刺激可以促进AD中的腐殖化并提高污泥导电性。具体而言，腐殖质是由前体（例如醌）通过非共价作用（例如π-π堆叠、范德华力和氢键）形成的超分子组装。这些非共价作用的强度与分子的极性状态相关。已有研究表明，微生物电解池（MEC）的电极-溶液界面可以诱导分子极化（Goldsmith等人，2020年；SEKI，1993年）。这种极化效应在富含π电子云和极性羰基的醌分子中尤为明显（Goldsmith等人，2020年）。在电场作用下，这些前体的强极化增强了分子间的静电吸引力，促进了π-π堆叠结构的形成。因此，可以合理假设电刺激通过极化醌基团来促进π-π堆叠结构的形成，从而驱动HS前体的自组装并加速腐殖化过程。此外，π-π堆叠结构的离域电子系统有助于在污泥中创建自由电子流，从而可能提高污泥导电性。理论上，污泥导电性的提高可以促进电活性微生物间的电子转移，从而直接增强基于DIET的甲烷生成途径。然而，这些考虑尚未在先前的研究中得到报道。

本研究的主要目标是：（1）研究电刺激对HS积累的影响；（2）确定这种积累对AD的后续影响；（3）阐明其对污泥导电性和DIET途径的影响。本研究旨在为MEC-AD系统中增强甲烷生成提供新的理论基础和策略。

实验装置与操作

连续流实验在两个上流式厌氧污泥覆盖层（UASB）反应器中进行，每个反应器的工作体积为1.0 L（Φ10.0 cm × 13.0 cm）。每个反应器配备了两块碳毡（5.0 cm × 10.0 cm × 1.0 cm；体积50 cm3）作为电极材料。其中一个反应器配置为MEC-AD系统，施加0.6 V的直流电压，称为电刺激组（E组），另一个作为无电压的对照组（C组）。

电刺激增强了甲烷生成性能

从图1可以看出，电刺激组的性能明显优于对照组（p < 0.05）。具体而言，消化后，电刺激组的甲烷生成速率保持在159 mL CH?/g VS，比对照组（130 mL CH?/g VS，图1A）高出22%。理论上，电极的阳极氧化与阴极还原共同促进了甲烷生成（Yuan等人，2025年）。在阳极处，

结论

本研究揭示，电刺激通过促进π-π堆叠加速了污泥的腐殖化过程，从而增强了AD效果。电场使腐殖质前体极化（偶极矩约为21 Debye），克服了熵障碍并促进了π-π堆叠，使腐殖酸（HA）含量显著增加了75.1%。这种超分子组装形成了一个原位导电网络，使电荷转移阻力降低了56%。13C同位素追踪进一步证实了这种增强效果

数据可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。

作者贡献

在本研究中，王璐军负责数据的获取和分析；姜志豪负责数据可视化；于启林和张耀斌负责工作的构思和设计；王璐军和张耀斌共同起草并修订了本文。

未引用的参考文献

Wang等人，2024年；Wang等人，2025年；Wang等人，2023年；Wang等人，2021年

CRediT作者贡献声明

王璐军：撰写——原始草稿，数据管理。姜志豪：数据可视化。于启林：概念设计。张耀斌：撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（22276024）和辽宁省科技计划（2023JH1/10400005）的财政支持。