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本研究运用孟德尔随机化（MR）方法，系统探讨了肠道菌群通过血浆代谢物（如3-乙基儿茶酚硫酸盐）影响失眠风险的潜在因果与中介机制，为“肠-脑轴”在睡眠障碍中的作用提供了新的遗传学证据，并提示了通过调节菌群代谢靶点改善睡眠障碍的潜在新策略。
摘要
本研究通过孟德尔随机化（Mendelian Randomisation, MR）方法，探究了血浆代谢物在肠道微生物组与失眠之间的中介作用。我们利用来自5959名个体的肠道菌群和来自8299名个体的血浆代谢物的公开可获取的全基因组关联研究（GWAS）数据，通过MR分析探讨了它们对失眠的因果效应。失眠结果数据来自Pan-UKB、GERA和FinnGen数据库，共包含9007例病例和871802例对照。使用系数乘积法计算了已识别的细菌类群通过血浆代谢物对失眠的中介效应。
结果表明，我们的MR分析中肠道菌群参与者平均年龄为45.7岁（SD = 11.5），血浆代谢物参与者平均年龄为63岁（范围45-85）。分析分别确定了10个可能与失眠相关的肠道微生物组和35个血浆代谢物。具体而言，某些肠道微生物组（如物种CAG-145 sp000435615）丰度的增加与更高的失眠风险相关。中介分析揭示，血浆代谢物3-乙基儿茶酚硫酸盐（3-ethylcatechol sulphate）水平显著介导了这些微生物对失眠的影响，解释了高达31.49%的总效应。
引言
失眠影响着全球相当大一部分人口，其患病率因人口因素而异。除了在入睡和维持睡眠、早醒以及睡眠无法恢复精力方面面临挑战外，失眠症患者还常常伴有日间过度嗜睡、疲劳、易怒和认知障碍。这些症状严重影响了日常功能和生活质量，导致生产力下降和事故风险增加。失眠的病因学是复杂的，包括遗传、心理和环境等多种因素。神经生物学模型表明，以下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴活动增加为标志的过度觉醒是关键机制。心理压力和不适应行为（如不良的睡眠卫生习惯）进一步加剧了这种情况。
如今，胃肠道微生物组与失眠之间的关联已成为一个重要的研究领域。最近的
研究强调了肠道菌群与失眠之间的相互关联。肠-脑轴，即胃肠道与中枢神经系统之间的通讯网络，是这种连接的关键。肠道菌群的改变可能影响睡眠模式，而睡眠紊乱又可以改变肠道菌群的组成。几项观察性研究探索了失眠个体中肠道菌群的多样性。例如，涉及16S rRNA测序的研究已识别出失眠患者与健康对照组之间肠道菌群组成的显著差异。孟德尔随机化（MR）研究也为肠道菌群与失眠之间的因果关系提供了见解。肠道菌群通过各种代谢物对其宿主产生影响，但影响失眠的具体代谢物仍不清楚。
为了填补这一知识空白，我们计划进行一项中介MR分析。这是一种用于流行病学和遗传学的统计技术，它利用遗传变异作为工具变量（IVs）来评估可改变的暴露对结果的因果效应。MR的核心原理是，在受孕时随机分配的遗传变异可用于推断暴露与结果之间的因果关系。只要满足特定假设，这种方法可以最大限度地减少混杂因素和反向因果关系。我们的目标是利用MR来确定特定的血浆代谢物是否介导了胃肠微生物组与失眠之间的关系。通过检查遗传变异对胃肠道菌群和血浆代谢物的影响，我们希望能更全面地了解它们在失眠中的作用。这一见解有可能通过促进创新诊断和治疗方法的发展，来革新失眠的管理。
材料与方法
研究设计
我们分析中使用的所有汇总级数据都是公开可获取的。本研究的设计如图1所示。最初，我们通过正向和反向MR以及连锁不平衡分数回归（Linkage Disequilibrium Score Regression, LDSC）分析探讨了胃肠微生物组与失眠之间的关系。同时，我们通过正向MR分析评估了与失眠相关的血浆代谢物。我们在荟萃分析中整合了这些MR和LDSC分析的结果，以使用不同的数据源全面评估失眠。在第二阶段，我们将先前识别出的胃肠微生物组与相关的血浆代谢物进行了比较。我们应用系数乘积法来评估这些微生物组通过血浆代谢物介导的对失眠的中介效应（ME）。我们的分析程序遵循了STROBE-MR指南。所有纳入的研究都获得了伦理批准，并获得了所有参与者的同意，遵守了其机构审查委员会或伦理委员会的指导方针。
肠道菌群数据来自FINRISK研究，涉及5959名欧洲血统的参与者。粪便样本在标准化条件下收集，包括向参与者提供有关饮食、药物使用以及在样本收集前特定时间内避免使用抗生素的详细说明。参与者在家里收集粪便样本，立即冷冻，并在受控条件下交付样本以保存微生物组成。肠道微生物组图谱通过全基因组鸟枪法宏基因组测序生成，从而鉴定出473个独特的细菌分类群。血浆代谢物数据来自加拿大老龄化纵向研究（CLSA），该研究涉及8299名欧洲血统的参与者，年龄在45至85岁之间。血浆样本在禁食一夜后收集，以确保代谢谱的一致性，参与者被要求在样本收集前至少禁食8小时。血浆代谢物通过高通量技术进行定量，包括液相色谱-质谱联用（LC-MS）和核磁共振（NMR）波谱。与失眠相关的信息从几个关键来源汇总，包括FinnGen GWAS Release 10、老龄化遗传流行病学研究（GERA）队列和Pan-UKB GWAS Version 0.4。失眠病例使用国际疾病分类第10版（ICD-10）代码（F51.0, G47.0）进行识别，总共有9007例失眠病例和871802例对照。使用在线工具来估计MR分析的统计效能。鉴于我们的样本数据来源于五个不同的数据库，我们有效地减轻了样本重叠的风险。
为了进行MR分析，工具变量（IVs）必须满足三个基本标准：（1）所选的遗传变异应与所研究的暴露有稳健关联；（2）这些变异必须独立于可能影响结果的其他因素，以避免混杂；（3）遗传变异与结果之间的关系应仅通过所讨论的暴露发生。当我们使用阈值p < 5 × 10-8并应用严格的连锁不平衡（LD）clumping设置（距离10,000 kb，IVs之间r2< 0.001）时，我们发现只有284个细菌分类群和839个血浆代谢物分别满足这些标准，总共有324个和2230个单核苷酸多态性（SNPs）。为了满足第一个MR分析假设，通过GWAS识别的暴露采用了阈值p < 5 × 10-6。对于每个SNP，使用公式F = beta2/se2计算F统计量，以确保弱工具变量的影响降低。F统计量低于10的SNP从分析中排除。为了确保一致性，对齐了暴露和结果数据集之间的效应等位基因，排除了任何不匹配的等位基因。此外，次要等位基因频率（MAF）接近0.5的模糊回文SNP也被丢弃以避免错误。没有使用代理SNP来替代缺失的IVs，因为缺失的工具比例很小，对结果影响最小。为了检测多效性，我们实施了MR多效性残差和与离群值（MR-PRESSO）检验和MR-Egger截距检验。我们从荟萃分析中排除了表现出显著水平多效性的MR估计值。最后，为了维护第三个MR假设，排除了与结果显著相关的SNP（p < 5 × 10-6）。在初步的IVs选择之后，正向MR分析纳入了1178个血浆代谢物和416个细菌分类群。
统计分析
在随机效应框架下，使用逆方差加权（Inverse-Variance Weighted, IVW）方法计算主要的MR估计值。当所有遗传变异都满足基本的MR假设时，可以获得最精确的估计，因为IVW方法在不存在水平多效性的情况下效率最高。此外，进行了三项敏感性分析：加权中位数法、MR-Egger法和MR-PRESSO法。当怀疑存在定向多效性时，MR-Egger非常有价值，因为它可以通过截距项检验多效性并提供更保守的估计。显著的截距值表明存在定向多效性。加权中位数法比IVW方法更不易失效，并在存在轻微多效性时提供更可靠的估计，尤其适用。如果存在或怀疑存在多效性，MR-PRESSO通过排除违反排除限制假设的离群变异的影响，提高了因果估计的准确性。应用Cochran’s Q检验来评估SNP之间的异质性。为了进一步研究水平多效性，进行了MR-Egger截距检验。截距或全局检验P值小于0.05表明存在显著多效性的SNP，以及涉及少于四个SNP的情况，被从荟萃分析中省略，因为MR-PRESSO要求至少四个SNP。最后，使用固定效应荟萃分析综合了IVW方法和敏感性分析的估计值。然而，显示出显著异质性或与敏感性分析不一致的IVW结果被排除。我们使用LDSC来研究失眠与先前识别的肠道菌群之间的遗传相关性。使用HapMap3作为参考，从GWAS数据中排除非SNP、MAF低于0.01的SNP、重复项以及链方向模糊的SNP。LDSC通过分析LD与检验统计量之间的关联，有效地识别遗传相关性。遗传相关性是通过将一个性状的变异z值与另一个性状的z值相乘，然后将这些乘积对LD分数进行回归来确定的。
进行中介分析以研究血浆代谢物是否介导肠道菌群与失眠之间的关系。该分析遵循两步法，应用系数乘积法，这是MR研究中广泛用于估计ME的技术。第一步，我们使用正向MR分析评估了肠道菌群与失眠之间以及血浆代谢物与失眠之间的直接关系。第二步，我们研究了血浆代谢物在已识别的肠道菌群与失眠关系中的中介效应。ME计算为微生物组-代谢物和代谢物-失眠关联系数的乘积。代谢物介导的总效应比例通过将中介效应除以肠道菌群对失眠的总效应来估计。使用bootstrap置信区间（CI）确定中介效应的显著性，p值< 0.05被认为具有统计学意义。针对正向MR分析中识别的特定肠道微生物组和血浆代谢物配对进行了中介分析。
为了控制错误发现率，在MR研究的荟萃分析中应用了Bonferroni校正。对于肠道菌群和血浆代谢物，当IVW p值分别小于1.20 × 10-4（0.05/416）和4.24 × 10-5（0.05/1178）时，认为因果关系显著，如果IVW p值介于上述阈值和0.05之间，则认为具有提示性关联。使用R软件（版本4.3.1）中的TwoSampleMR和meta包进行所有分析。
结果
参与者和失眠患病率
我们的分析利用了来自多个大规模GWAS的汇总级数据。参与者包括来自FINRISK研究的5959名欧洲血统个体，平均年龄45.7岁（SD = 11.5），其中50%为男性。血浆代谢物数据来自CLSA，包括8299名45至85岁的欧洲血统个体（平均年龄=63岁），男性占52%。失眠数据汇总自三个来源：FinnGen（4801例病例和405,229例对照；平均年龄=53±18岁，44%为男性）、GERA（3,972例病例和52,665例对照，平均年龄=63岁，范围19至100岁以上，42%为男性）和Pan-UKB（234例病例和413,908例对照；平均年龄=55.1±7.6岁，48%为男性）。这些人群中失眠的合并患病率约为1.02%（880,809名参与者中有9007例病例）。
肠道菌群与失眠
对416个细菌分类群进行了荟萃分析。最终，我们识别出10个与失眠提示性相关的肠道微生物组。合并的IVW估计值显示，基因预测的物种CAG-145 sp000435615（OR = 1.265, 95% CI 1.003, 1.597; p = 0.007）和另外3个肠道微生物组与失眠风险增加提示性相关。此外，我们发现基因预测的棒状杆菌属（Corynebacterium）（OR = 0.387, 95% CI 0.195, 0.769; p = 0.007）和另外5个肠道微生物组与失眠风险降低提示性相关。
在失眠与先前识别的10个肠道微生物组之间进行了反向MR分析。合并的IVW估计值未检测到失眠与先前识别的细菌之间存在双向因果关系。
由于遗传力低和样本量小，只有4个先前识别的肠道微生物适合进行LDSC分析。然而，我们未检测到失眠与先前识别的细菌之间存在遗传相关性。所有遗传相关性结果的详细信息在补充表中列出。
血浆代谢物与失眠
正向MR研究结果显示，基因预测的35个血浆代谢物与失眠存在潜在因果关系。随后，进行了350次MR分析，以检验已识别的细菌分类群与血浆代谢物之间的关系。共有3对肠道微生物组和血浆代谢物被纳入中介分析。其中，物种CAG-145 sp000435615的遗传易感性与3-乙基儿茶酚硫酸盐（3-ethylcatechol sulphate）水平存在因果关系。
中介分析
对3对特定的肠道微生物组和血浆代谢物配对进行了中介分析。具体而言，物种CAG-145 sp000435615通过3-乙基儿茶酚硫酸盐水平间接影响失眠，其中介效应（ME）为0.074（95% CI 0.006, 0.141, p = 0.032）。中介比例为31.49%。
敏感性分析、多效性与异质性
在数据处理过程中，我们排除了与敏感性分析（加权中位数、MR-Egger和MR-PRESSO）不一致或表现出显著多效性的IVW估计值，以保持我们研究结果的稳定性和有效性。大多数SNP（Cochran’s Q检验）和荟萃分析结果没有或仅有轻微异质性，证明了我们分析的稳健性。
讨论
我们的研究整合了MR和LDSC，利用GWAS数据，探讨了肠道菌群、血浆代谢物和失眠之间的关系。正向MR分析识别出几种与失眠相关的肠道微生物组。值得注意的是，物种CAG-145 sp000435615的遗传易感性与失眠风险增加提示性相关。相反，棒状杆菌属与失眠风险降低相关。中介分析揭示，3-乙基儿茶酚硫酸盐等血浆代谢物介导了这种关系，约占失眠影响的31.49%，凸显了肠道菌群在睡眠调节和潜在治疗途径中的重要作用。
观察性研究揭示了特定肠道菌群与失眠之间的显著关联。与健康对照组相比，失眠症患者的肠道菌群组成显示出明显的改变。一个重要发现是，失眠与微生物丰富度和多样性的减少有关，特别是在慢性失眠患者中，产短链脂肪酸（SCFA）的厌氧菌数量减少，而潜在的病原菌（如Blautia和Lachnospira）数量增加。此外，较高的拟杆菌属（Bacteroides）水平与患有抑郁症和焦虑症个体的睡眠质量差相关，表明肠道菌群与失眠以外的睡眠障碍之间存在联系。使用粪便微生物群移植（FMT）的动物研究表明，将失眠症患者或应激动物的肠道菌群移植到健康动物体内，可以诱发类似失眠的症状。研究表明，乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）等肠道细菌在调节睡眠和应激反应中起着关键作用。此外，动物模型揭示，特定的微生物群落，如富含拟杆菌门（Bacteroidetes）的群落，可以通过与宿主免疫和代谢途径的相互作用来影响睡眠模式。有助于推断因果关系的MR研究表明，肠道菌群的某些分类群与失眠风险相关。具体而言，瘤胃菌科（Ruminococcaceae）家族和毛螺菌科（Lachnospiraceae）属被观察到会增加失眠风险，而黄杆菌属（Flavonifractor）和奥尔森菌属（Olsenella）似乎能减轻这种风险。另一项孟德尔随机化研究显示，负菌纲（Negativicutes）以及无害梭菌群（Clostridium innocuum group）和多尔氏菌属（Dorea）与较高的失眠风险相关，而双歧杆菌属（Bifidobacterium）等一些分类群显示出潜在的保护作用。总之，这些研究强调了肠道菌群在睡眠调节中的关键作用，并表明特定的微生物改变可能作为失眠的潜在生物标志物和治疗靶点。
物种CAG-145 sp000435615属于厚壁菌门（Firmicutes）、梭菌纲（Clostridia）、消化链球菌目（Peptostreptococcales）、厌氧菌科（Anaerovoracaceae）和CAG-145属，是从宏基因组组装参考基因组中定义的一种未培养物种。遗憾的是，在流行的生物学数据库或文献中没有关于这个特定物种的现成详细信息。然而，厌氧菌科内某些新发现的属，其特征是能够利用硫化合物。这种利用可能会降低硫酸盐水平。这与我们的发现相符，即物种CAG-145 sp000435615与失眠风险增加相关，这种关联是通过降低3-乙基儿茶酚硫酸盐水平介导的。3-乙基儿茶酚硫酸盐是儿茶酚（一种苯酚）的衍生物，经过乙基化和硫酸化。研究表明，肠道菌群的代谢副产物，如3-乙基儿茶酚硫酸盐，可以通过肠-脑轴影响大脑功能和行为。这条轴涉及包括内分泌、免疫和神经机制在内的双向通讯通路。这些代谢物的减少可能会扰乱这种通讯并导致睡眠障碍。此外，3-乙基儿茶酚硫酸盐可能参与了多巴胺等神经递质的代谢，而多巴胺在调节睡眠-觉醒周期中起着至关重要的作用。多巴胺等儿茶酚胺对于维持觉醒是必不可少的，其代谢紊乱会影响睡眠模式。这些神经递质的硫酸盐结合物（如3-乙基儿茶酚硫酸盐）通常参与其降解和排泄。因此，较低的水平可能表明多巴胺代谢改变，可能导致睡眠结构紊乱或维持觉醒的能力受损。还有一种理论将氧化应激和睡眠调节联系起来。儿茶酚及其代谢物具有抗氧化特性。3-乙基儿茶酚硫酸盐等化合物的减少可能意味着中和氧化应激的能力降低，而氧化应激与睡眠质量差和失眠有关。降低的3-乙基儿茶酚硫酸盐水平与增加的失眠风险之间的关联，与当前强调代谢失衡、炎症过程和神经生物学应激反应在失眠病理生理学中作用的理论相一致。这些发现表明，靶向代谢和炎症途径可能为管理失眠提供新的治疗途径。
我们的研究具有几个优势。首先，该研究利用了MR分析，这是一种强大的统计方法，有助于推断因果关系，最大程度地减少了混杂因素和反向因果关系。其次，该研究利用了涉及大样本量的公开GWAS数据。它包括了超过9000例失眠病例和超过871,000例对照，增强了研究的统计功效和可靠性。第三，该研究通过正向和反向MR分析探索了肠道菌群-失眠联系，还探讨了血浆代谢物的中介作用，从而对微生物组-睡眠健康关系有了更细致的理解。最后，使用荟萃分析、敏感性分析（例如MR-Egger、加权中位数、MR-PRESSO）和通过LDSC进行的遗传相关性检验，增强了结果的可信度。这些方法可以检测并解释多效性和异质性，确保研究结果稳定有效。
在解释我们的发现时，必须考虑到MR研究的几个局限性。首先，失眠和肠道菌群组成等性状的表型定义可能无法完全捕捉其复杂性。尽管使用了大规模的GWAS数据，但由于自我报告偏差或诊断不一致，表型数据可能缺乏精确性。其次，MR研究假设遗传变异与在单一时间点测量的暴露相关，忽略了随时间变化的因素，如肠道菌群或血浆代谢物的波动。这一限制可能阻碍检测受环境变化影响的因果关系。第三，基因-环境相互作用可能影响肠道菌群、血浆代谢物和失眠之间的关联。虽然MR减少了混杂，但不能完全解释饮食、压力或药物使用等环境因素的影响，这些
