编辑推荐：
本研究通过质子磁共振波谱（1H-MRS）技术，揭示了联合补充组合人乳寡糖（cHMOs）与乳铁蛋白（Lf）相较于单一补充cHMOs，能在新生仔猪模型中通过增强脂质代谢、能量稳态（tCr）及抗氧化防御（GSH）等协同机制，更显著地促进脑发育关键代谢物（tLM, tCho）水平，为早期营养干预优化神经发育提供了新的转化医学证据。
引言
生命最初的1000天（从受孕到两岁）是神经发育最关键的窗口期，涉及突触发生、髓鞘形成和神经回路精修等快速过程。早期营养在这一过程中扮演着可调节的重要角色。母乳不仅能支持躯体生长，其富含的生物活性分子更能主动调节神经发育与认知功能。其中，人乳寡糖（HMOs）是母乳中仅次于乳糖和脂质的第三大组分，包含超过200种结构，主要分为中性岩藻糖基化、中性非岩藻糖基化和唾液酸化类型。它们在初乳中浓度约为20-25 g/L，成熟乳中为5-20 g/L，而目前市售的婴儿配方奶（主要源于牛乳）其寡糖含量低100-1000倍。尽管婴儿自身不消化HMOs，但其可作为共生菌的底物，调节肠道微生物群，并促进神经活性代谢物如短链脂肪酸（SCFAs）的产生。唾液酸化HMOs，如3′-和6′-唾液酸乳糖（3′-SL和6′-SL），已在动物模型中被证明可通过增加神经细胞粘附分子（NCAM）的多唾液酸化（一种突触可塑性和神经发生的关键调节因子）以及提升神经节苷脂表达和海马结构变化来促进脑发育。
迄今，大多数关于HMOs驱动神经发育的研究都集中在岩藻糖基化结构上，这很大程度上是由于食品级唾液酸化HMOs的有限可得性。在唾液酸化HMOs中，3′-SL被研究得更多，尽管6′-SL更为丰富且更能反映早期人乳成分。鉴于HMOs的结构多样性，其效应很可能由协同相互作用介导。然而，评估唾液酸化和中性HMOs联合效应对神经发育影响的研究很少，这凸显了在临床前模型中研究混合配方（特别是岩藻糖基化和唾液酸化类型的混合物）以更准确捕捉人乳复杂性的必要性。
乳铁蛋白（Lf）是一种铁结合的唾液酸化糖蛋白，是人乳中第二丰富的乳清蛋白。最近的研究表明，Lf通过上调脑源性神经营养因子（BDNF）和多唾液酸（polySia）表达、增强海马神经发生、减少氧化应激和神经炎症来促进神经发育和认知，这些是早期脑回路形成的关键机制。进一步的研究显示，较低浓度（约0.5 g/L）支持神经发育，而较高剂量（约1 g/L）则提供更强的神经保护作用。然而，关于HMOs和Lf补充对体内脑生物化学（尤其是在转化模型中）协同效应的直接证据仍然有限。
质子磁共振波谱（1H-MRS）提供了一种强大的、非侵入性的体内神经化学谱定量方法，能够检测关键代谢物，如N-乙酰天冬氨酸（NAA）、谷氨酸（Glu）、胆碱（Cho）和肌醇（mI），这些是神经发育过程中神经元活性、突触完整性和胶质功能的关键标志物。MRS也被用于检测与神经元和胶质细胞成熟相关的营养诱导的代谢物变化。近期一项在新生仔猪中的研究显示，唾液酸化HMOs改变了脑肌醇（Ins）、谷氨酰胺（Gln）和Glu水平，凸显了MRS对早期营养效应的敏感性。短回波时间（TE，20-40毫秒）对于检测信号衰减快的代谢物特别有效，能够进行更广泛的神经代谢谱分析，因此短TE 1H-MRS非常适合评估婴儿发育转化模型中饮食诱导的脑变化。
仔猪因其脑回结构、出生后快速生长以及与人类可比的神经发育时间线，成为研究婴儿脑发育的成熟模型。其胃肠道生理结构与人类婴儿非常相似，支持了肠道-脑轴的研究。值得注意的是，与牛乳相比，猪乳含有更类似于人类的寡糖谱，尤其是唾液酸化形式。利用这些相似性，本研究使用1H-MRS研究HMOs单独或联合Lf补充对仔猪脑神经代谢谱的影响，为早期饮食干预如何优化脑发育和认知结局提供了转化视角。
方法
伦理声明
研究方案获得了查尔斯·斯特大学（项目ID：A23566）和莫纳什大学（项目ID：38776）动物护理与伦理委员会（ACEC）的批准。研究遵循机构和国家的动物护理与使用研究指南进行。
动物模型与饲养
雄性家养仔猪（大白×杜洛克×比利时兰德瑞斯品种）在出生后第3天（PND 3）从商业育种场获取（n=48；体重1.5-2.6 kg）。仔猪按体重和窝源分层，然后随机分配到三个实验组之一（蓝、黄、紫）。仔猪成对饲养在温控围栏内，每个围栏配备环境丰容物。环境温度最初维持在27°C，到PND 21逐渐降至23-25°C。整个研究期间保持12小时光照/12小时黑暗周期。在研究的前两周，损失了四头仔猪（对照组两头，cHMOs+Lf组两头）。一头因肠套叠死亡，一头因多器官功能障碍被安乐死，两头死于肺炎和败血症，最终队列为44只动物。所有研究人员对分组分配设盲。
动物饲喂
仔猪从PND 3至38/39饲喂标准母猪代乳粉。通过将3′-SL和6′-SL、2′-FL或Lf以指定浓度混合到代乳粉中，制备了三种实验日粮。最终浓度因组而异：cHMOs组接受1.8 g/L cHMOs（70% 2′-FL和30%唾液酸化HMOs，3′-SL与6′-SL比例为1:2.5；n=16）；联合cHMOs+Lf组接受1.8 g/L cHMOs和0.5 g/L Lf（n=14）；对照组接受1.8 g/L甲基纤维素（n=14）。所有日粮的营养成分详见文中表格。配方设计确保各组间营养摄入量可比，HMOs和Lf是唯一不同的成分。饲喂和饲养遵循既定方案。为维持正常生长速率，仔猪在前两周按285 mL/kg/天饲喂，随后几周为230 mL/kg/天。每日喂食四次，在最后一次饲喂时额外提供50 mL。每天早晨饲喂前使用数字秤记录体重，并在整个研究期间监测奶摄入量和健康状况。
MRS数据采集
所有仔猪脑神经成像在PND 38或39进行，使用西门子Skyra 3T MR扫描仪。在1H-MRS之前，仔猪禁食至少4小时。使用5%异氟烷诱导麻醉3-5分钟，成像期间维持2-3.5%以最小化运动伪影。使用尾夹式传感器连续监测生命体征。每只仔猪的总扫描时间约为45分钟。
MRS数据采集使用先前发表的方案。简言之，1H-MRS使用单个体素自旋回波点分辨波谱（PRESS）序列（TR=2000 ms；TE=30 ms）进行，体素定位于额叶灰质和白质（左右15 mm，上下14 mm，前后20 mm）。所有成像程序由专业成像科学家进行。MRS后，仔猪通过心内注射安乐死液被安乐死。
MRS数据分析
1H-MRS数据使用TARQUIN软件（版本4.3.10）处理，该软件能够自动量化长、短回波时间的代谢物。在时域中使用“高级拟合”选项和非负最小二乘拟合算法进行分析。对水抑制谱应用涡流校正，代谢物浓度以机构单位计算，无需进一步T2弛豫校正。
统计分析
使用单变量一般线性模型（GLM）进行组间个体脑代谢物浓度的比较，调整初始体重、大脑重量、粪便评分和奶摄入量等协变量。代谢物浓度以绝对值及相对于tNAA的比值表示。统计学显著性定义为P<0.05。所有统计分析在IBM SPSS Statistics中进行。
结果
脑代谢物的绝对浓度
使用TARQUIN软件自动量化了三组仔猪33种脑代谢物的绝对浓度。38/39日龄仔猪三组中33种代谢物的平均绝对浓度如图所示。
在分析的33种脑代谢物中，联合cHMOs+Lf组的绝对tLM浓度最高（173.25 ± 29.78 mM），其次是cHMOs组（146.88 ± 9.93 mM）和对照组（132.52 ± 10.01 mM）。组间总体差异具有统计学显著性（P<0.05），事后分析显示cHMOs+Lf组与对照组之间存在显著差异（P<0.05）。联合cHMOs+Lf组tLM浓度的升高意味着脂质代谢增强，这一过程通常与脑发育、成熟、髓鞘形成、神经元膜合成和能量代谢相关。此外，cHMOs+Lf组的Ala、Cr、GSH、Lip和MM水平升高，但组间总体差异未达到统计学显著性。
相比之下，tNAA浓度在单独cHMOs组最高（122.32 ± 3.98 mM），其次是对照组（120.98 ± 3.90 mM）和联合cHMOs+Lf组（105.54 ± 5.75 mM）。组效应总体显著（P<0.05），事后分析证实cHMOs组与cHMOs+Lf组之间存在显著差异（P<0.05）。cHMOs组tNAA浓度升高可能表明神经元完整性或代谢功能增强，这与NAA在脑代谢中的既定作用一致。
此外，单独cHMOs组在与神经元功能和能量代谢相关的几种代谢物（包括Asp、GABA、Glc、Lac、NAAG、PCh、PCr、SI、Tau、tCho和tCr）上表现出最高浓度，尽管这些差异未达到统计学显著性。虽然不显著，但与cHMOs+Lf组和对照组相比，cHMOs组的GABA水平高出18-33%，表明抑制性神经传递增强、潜在的神经发育益处和神经功能改善，凸显了单独补充cHMOs对神经递质代谢的独特影响。
脑代谢物的相对浓度（与tNAA的比值）
将代谢物浓度标准化为tNAA，tNAA是神经元完整性和密度的稳健标志物，在发育中的大脑中相对稳定，使其在此背景下成为更合适的内参。
在分析的33种脑代谢物中，cHMOs+Lf组的tCho、tCr和tLM的平均相对浓度（与tNAA的比值）显著更高（分别为0.29 ± 0.01、0.99 ± 0.04和2.39 ± 0.22），其次是cHMOs组（分别为0.25 ± 0.01、0.87 ± 0.03和1.72 ± 0.12），然后是对照组（分别为0.23 ± 0.01、0.84 ± 0.03和1.53 ± 0.11）；组间总体差异具有统计学显著性（P<0.05）。GSH浓度在cHMOs+Lf组最高（0.23 ± 0.02），其次是对照组（0.18 ± 0.01）和cHMOs组（0.17 ± 0.02）。组间总体差异具有统计学显著性，事后分析发现cHMOs+Lf组与cHMOs组之间存在显著差异（P<0.05）。在调整初始体重、大脑重量、奶摄入量和粪便评分后，这些差异变得更加明显，强调了Lf补充与代谢物水平升高之间的强关联（P<0.05）。功能上，GSH是支持神经元保护和氧化还原平衡的关键抗氧化剂；tCho反映膜周转和胆碱能神经传递；tCr作为能量缓冲维持ATP稳态；tLM代表与髓鞘形成和脑成熟相关的脂质和大分子含量。总的来说，cHMOs+Lf组和cHMOs组中这些代谢物的升高表明，单独或联合补充cHMOs可能增强神经发育、神经保护和能量代谢。
cHMOs+Lf组几种主要脑代谢物的浓度更高，包括Asp、Ins、PCr、GPC和NAA，但这些差异未达到统计学显著性。这些代谢物在神经发育过程中扮演关键角色，包括细胞信号传导、出生后髓鞘形成和神经保护，表明联合补充HMOs和Lf可能带来潜在的神经发育优势。
相反，cHMOs组的SI水平显著更高，比对照组和cHMOs+Lf组高出11-15%。SI参与增强神经发生，并可能通过支持细胞功能和防止蛋白质聚集来提供神经保护作用，表明单独补充cHMOs可能特异性减轻神经元毒性并保护突触功能，这是脑发育的关键过程。
讨论
本研究首次提供了关于HMOs和Lf联合对新生仔猪脑代谢物和神经递质谱协同效应的科学证据，揭示了单独补充HMOs与HMOs联合Lf之间不同的代谢反应，这些反应可能支持神经发育。联合cHMOs+Lf组在绝对和相对浓度上都表现出最高的tLM水平，而对照组最低。由于tLM代表脂质和大分子含量，这些升高表明髓鞘形成、神经元膜合成和脂质代谢增强，这些是脑成熟的关键过程。此外，增强的脂质动员可能归因于Lf对脂质合成和周转的调节作用。观察到的tLM增加可能反映了对神经发育至关重要的适应性脂质重塑过程，包括膜生物合成、髓鞘形成和能量稳态。
研究还表明，tCr和tCho的相对浓度遵循与tLM相似的模式：联合Lf+HMOs组水平最高，HMOs组处于中间水平，对照组水平最低。肌酸通过磷酸肌酸（PCr）系统在脑能量代谢中发挥至关重要作用，支持ATP再生。它还能通过促进神经递质合成、调节突触可塑性和保护神经元免受氧化应激来增强认知功能。胆碱是乙酰胆碱和甜菜碱合成所必需的，有助于渗透调节，并作为磷脂、鞘脂和卵磷脂的前体，这对膜完整性和髓鞘形成至关重要。tCho水平升高反映了膜磷脂周转增加，与发育中大脑的活跃结构生长、髓鞘形成和膜完整性增强一致。同时，较高的tCr水平表明能量储存和转移改善，支持脑生长或应激适应期间的高代谢需求。总的来说，这些发现表明Lf联合cHMOs可能促进认知发展、神经保护、神经结构成熟和整体脑健康。
出乎意料的是，cHMOs+Lf组的GSH水平显著高于cHMOs组和对照组，而cHMOs组的浓度最低。这种升高表明通过增强氧化还原稳态来提高抗氧化能力和改善细胞保护。除了其在氧化还原平衡中的作用外，GSH还有助于外源性物质解毒、氨基酸转运和蛋白质功能调节。它防止半胱氨酸和谷氨酸毒性，并调节对突触传递和神经可塑性至关重要的谷氨酸能信号传导。新出现的证据表明，GSH可能作为一种神经递质，作用于特定受体，并可能影响学习和记忆过程。观察到的模式表明，Lf可能与HMOs协同作用，在快速脑生长期间通过调节氧化平衡来增强神经保护效应。总的来说，这些发现表明，联合补充cHMOs和Lf可能在关键的神经发育窗口期促进脑成熟、能量代谢、抗氧化防御和结构发育。
此外，cHMOs+Lf组的Ins（或肌醇）水平比cHMOs组和对照组高6-9%。肌醇在中枢神经系统的细胞信号传导过程中至关重要，并作为神经胶质细胞（特别是星形胶质细胞）的标志物。它在胎儿脑发育和渗透调节中也起着关键作用。除了支持膜结构、囊泡运输、细胞存活和性成熟外，肌醇还作为肌醇脂质和磷酸盐的前体，调节增殖、分化和凋亡。脑Ins的类似增加先前在补充联合SL和6′-SLN的仔猪中有报道，表明HMOs可以在神经发育过程中影响肌醇相关的代谢途径。值得注意的是，唾液酸化HMO补充已被报道可上调胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（一种典型的星形胶质细胞标志物）的表达，表明对星形胶质细胞状态的调节。重要的是，GFAP表达增加与脑Ins水平升高相关，这与肌醇在星形胶质细胞内富集并反映星形胶质细胞代谢和渗透活性一致。此外，Lf在早期神经发育程序中具有既定作用，包括激活BDNF信号传导、增强多唾液酸化，并且在临床前模型中调节脑代谢结局和胶质反应。总的来说，这些发现支持了cHMOs+Lf组中观察到的较高肌醇水平可能反映了HMOs和Lf对星形胶质细胞相关代谢过程的协同效应。
在cHMOs+Lf组中，绝对NAA浓度没有增加，但与能量代谢（Cr）、膜周转（tCho）和氧化还原调节（GSH）相关的其他代谢物水平升高。这种模式表明，神经元代谢需求可能是通过替代或互补的代谢途径得到支持，而不是仅仅通过增加NAA水平。此外，NAA的相对浓度（表示为与tNAA的比值）在cHMOs+Lf组最高，表明在更广泛的代谢背景下，NAA仍保持比例丰富。总的来说，这些发现表明是代谢资源的重新分配，而非神经元功能受损。
单独cHMOs组表现出最高的tNAA浓度，这是神经元密度和生存能力的标志物，与cHMOs+Lf组和对照组相比。尽管NAA传统上与髓鞘形成和通过天冬氨酸酰化酶的碳转移有关，但它越来越多地被认为在细胞信号传导中起作用，特别是在调节组蛋白乙酰化中。此外，在cHMOs组中观察到NAAG（一种谷氨酸释放调节剂和突触可塑性及神经保护促进剂）水平升高。总的来说，这些发现意味着单独cHMOs可能特异性支持神经元完整性和生存能力，增强神经元代谢，并促进突触功能，表明独立于Lf补充的独特神经发育和神经保护效应。
此外，cHMOs组表现出高出18-33%的GABA水平，GABA是一种关键的抑制性神经递质，可维持突触平衡并支持认知过程。同时，在cHMOs组中观察到更高水平的SI，这是一种与减少淀粉样蛋白聚集、保护突触完整性和增强神经发生相关的代谢物。总的来说，这些发现表明，单独cHMOs可能通过调节多种代谢途径来增强神经发育稳定性。cHMOs和cHMOs+Lf补充影响脑代谢和神经传递的提议机制如图所示。
本研究中使用的HMOs和Lf剂量是基于先前证明其神经发育和代谢效应的研究精心选择的。唾液酸化HMOs的剂量来源于哺乳期3′-SL和6′-SL的平均浓度，3′-SL:6′-SL比例为1:2.5，与成熟人乳中的水平一致。2′-FL剂量基于人乳中中性（50-70%）和唾液酸化（10-30%）HMOs的典型分布。Lf剂量经过精心选择，以反映成熟人乳和母猪过渡乳中的天然水平，确保跨物种的生理相关性。为了标准化纤维含量并最小化对肠道微生物群的混杂效应，对照组施用相当于总HMOs剂量的甲基纤维素。
先前的研究报告了关于HMO补充对仔猪神经递质和脑代谢物谱影响的不同结果。一项研究调查了牛源改性乳清蛋白富集SL在不同浓度下30天的影响，未发现脑代谢物谱的显著改变。值得注意的是，该配方在对照和实验日粮中均包含DHA、ARA、GOS和PDX，这可能混淆了SL对神经代谢物水平的孤立效应。同样，2′-FL与低聚果糖（OF）或牛乳寡糖（BMOS）联合施用并未导致整体代谢状态的显著改变。这些研究使用了针对海马背侧的自旋回波化学位移序列。相比之下，另一项研究使用了针对额叶皮质和白质的PRESS序列，报告了在补充纯SL和6′-唾液酸乳糖胺（6′-SLN）后，Glu、mIns和Glx水平显著增加。此外，治疗组的tNAA、PCr、SI和tCho的平均绝对浓度比对照组高2-15%。研究间的差异也反映了剂量、评估时间以及分析标准（如使用Cramer-Rao下界）的不同。解决这些因素对于就HMO对脑代谢的影响得出一致结论至关重要。
虽然本研究采用双盲随机对照设计，并仔细最小化了混杂变量，但仍需考
