《Emerging Microbes & Infections》：Glutamine antagonist DON attenuates chikungunya virus-induced myositis by suppressing inflammatory activation in a murine model
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本研究探讨了靶向宿主能量代谢通路（糖酵解与谷氨酰胺分解）在基孔肯雅病毒（CHIKV）感染中的治疗潜力。通过体内外实验，研究发现谷氨酰胺拮抗剂DON可显著减轻病毒感染引起的肌炎和免疫病理损伤，其机制是通过抑制脾脏固有免疫细胞（如单核/巨噬细胞）的募集以及削弱CD4+、CD8+T细胞的活化、增殖与效应功能，从而在维持基础抗病毒能力的同时，将免疫病理反应与病毒控制“解耦”。这一发现为甲病毒等自限性感染引发的过度免疫损伤提供了靶向宿主代谢的干预新策略。
引言
基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种蚊媒甲病毒，感染后可导致严重的多关节痛和肌炎，超过75%的患者会出现持续性或复发性关节疼痛，目前尚无特异性抗病毒药物或靶向疗法获批。现有治疗主要依赖镇痛药和非甾体抗炎药，因此亟需开发基于病理机制的干预方法。CHIKV感染通常会在1-2周内清除病毒血症，但组织损伤主要由过度的免疫反应介导，其中巨噬细胞和CD4+T细胞是关键的病理介质。细胞能量代谢深刻调控免疫细胞的活化与功能，而靶向糖酵解或谷氨酰胺分解已被证明可在其他感染模型中减轻免疫病理。本研究旨在系统评估并比较糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）与谷氨酰胺拮抗剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（DON）在CHIKV感染小鼠模型中的疗效与机制。
材料与方法
研究使用6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，通过左后肢足垫皮内接种104PFU的CHIKV（亚洲谱系毒株KC488650）建立感染模型。对照组接种模拟感染的BHK-21细胞上清。感染后，每日监测小鼠体重变化并使用数显卡尺测量足垫肿胀程度。为进行代谢干预，在感染前0.5小时开始，连续5天腹腔注射2DG（1 g/kg）或DON（0.3 mg/kg），对照组注射PBS。小鼠在感染后第7天（dpi）处死，收集血清、足部组织及脾脏用于后续病毒学、组织病理学和免疫学分析。
病毒载量通过噬斑试验和定量RT-PCR检测病毒正链与负链RNA进行评估。组织病理学分析则将足部组织固定、脱钙、石蜡包埋后切片，进行H&E染色，评估肌纤维坏死、炎症浸润等病变。利用流式细胞术分析脾脏免疫细胞组成，包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞以及T细胞亚群（CD4+、CD8+）。通过SCENITH（基于嘌呤霉素掺入的蛋白合成测定）分析T细胞的代谢依赖性。此外，还检测了T细胞的活化标志物（CD44）、增殖标志物（Ki-67）、效应功能（IFN-γ、TNF-α、IL-17、CD107a）以及分化状态（初始、效应、记忆亚群）。
结果
实验性CHIKV感染在成年小鼠中诱导病毒学与免疫学变化
成年C57BL/6小鼠感染CHIKV后，未出现显著的体重减轻或足部肿胀。足部组织中的病毒复制在感染后6-7天达到峰值，到16天时迅速下降至低水平，约40%的小鼠实现了病毒清除。感染诱导了以Th1型为主的免疫反应，并在16 dpi时可在大多数小鼠中检测到病毒特异性产生IFN-γ的T细胞。所有感染小鼠均出现了典型的急性病理变化，其特征为多灶性肌纤维坏死、密集的炎症浸润和间质水肿，病变主要局限于注射足的肌肉组织。
谷氨酰胺分解抑制在不影响病毒载量的情况下消除CHIKV诱导的免疫病理
在体外细胞实验中，葡萄糖或谷氨酰胺剥夺，以及使用2DG或DON进行药理学抑制，均能显著抑制CHIKV在哺乳动物细胞系中的复制。然而在体内，由于抑制剂的组织生物分布差异，无论是2DG还是DON均未显著降低急性感染小鼠血清或足部组织中的病毒载量。引人注目的是，尽管病毒载量相当，DON（而非2DG）几乎完全消除了肌炎的组织病理学表现和炎症浸润。组织学分析显示，DON处理组炎症浸润消失，肌肉结构得以保留，仅见散在的骨骼肌细胞变性，表明其保护作用与病毒复制水平无关，成功实现了免疫介导的病理与病毒控制的“解耦”。
全身性代谢抑制剂介导未感染小鼠的组织选择性免疫调节
在未感染小鼠中单次给予2DG或DON后，分析其分子靶点的表达。结果显示，2DG的靶点Hk2 mRNA在脾脏中中度降低，但在其他组织中无变化；DON的靶点谷氨酰胺酶（Gls）在脾脏中显著下调，在足部组织中也有所减少，但在骨骼肌和心脏组织中保持不变。此外，DON处理显著降低了足部组织中趋化因子Ccl3和Ccl5的表达，而对Ifnb和Isg15影响甚微，表明其在削弱炎症细胞趋化能力的同时，保留了基础的先天抗病毒活性。这些发现证明，全身给予代谢抑制剂优先调节淋巴器官而非肌肉骨骼组织。
进一步的表征发现，脾脏淋巴细胞组成虽未改变，但发生了深刻的代谢重编程。SCENITH分析显示，2DG同时抑制了CD8+和CD4+T淋巴细胞的蛋白质合成，并增加了糖酵解能力、降低了线粒体氧化代谢。DON则引起轻微的代谢扰动。这些代谢改变与免疫细胞的功能受损相对应，表现为IFN-γ+和颗粒酶B+CD8+T细胞频率的轻度减少。CD4+T细胞的增殖、功能和迁移能力未受显著影响。总之，全身性代谢抑制剂主要对脾脏免疫细胞发挥免疫抑制作用，而非在病毒复制部位产生直接抗病毒活性。
谷氨酰胺分解抑制选择性重塑CHIKV感染期间的脾脏免疫细胞组成
CHIKV感染诱导了脾脏髓系细胞相对未感染小鼠的选择性扩增，包括巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞频率升高。在感染小鼠中，2DG处理并未显著改变这些感染诱导的免疫细胞频率。相比之下，DON给药在固有免疫和适应性免疫区室均诱导了选择性免疫抑制。与生理盐水处理的对照组相比，巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和B细胞的频率均降低，甚至降至低于未感染小鼠的基线水平。这种细胞类型特异性的过度抑制在作为CHIKV病理中炎症细胞募集关键启动者的巨噬细胞和单核细胞中最为明显。值得注意的是，T细胞对DON介导的数量减少具有抵抗性，其CD8+和CD4+T细胞频率与生理盐水处理的对照组相当，表明DON对T细胞的影响是定性而非定量的免疫调节。
DON抑制病毒诱导的T细胞活化和效应分化
对感染后7天未经刺激的脾细胞进行流式分析发现，与生理盐水对照组相比，DON处理组（而非2DG组）病毒驱动的T细胞活化标志物广泛减弱。抗原经验T细胞的标志物CD44在DON处理小鼠的CD8+和CD4+T细胞上表达显著降低。效应细胞因子（IFN-γ、TNF-α）、细胞毒性标志物（CD107a）和增殖标志物（Ki-67）的本底表达在DON处理后于两个T细胞亚群中均呈现平行下降。这些分子平均荧光强度的降低证实了DON在单个细胞水平的抑制作用。
DON给药从根本上重塑了CD8+T细胞的分化格局。效应（CD127-CD44+）和记忆（CD127+CD44+）群体急剧收缩，而初始（CD127+CD44-）表型成为主导。记忆亚群分析显示，效应记忆T细胞（TEM， CD62Llo）优先丢失，中央记忆T细胞（TCM， CD62Lhi）成为主要群体。CD4+T细胞表现出类似但减弱的分化阻滞，尽管效应亚群减少，但记忆池的完整性得以保留。这些数据表明，DON介导的谷氨酰胺分解抑制了病毒诱导的T细胞活化和效应分化，从而在损害抗病毒T细胞免疫的同时减轻了免疫病理。
谷氨酰胺分解限制削弱了多功能T细胞反应
为评估急性感染期间抗病毒T细胞的功能潜力，用PMA/离子霉素刺激脾细胞以评估不依赖于抗原特异性的效应能力。功能分析显示，2DG处理小鼠的T细胞反应性得以保留，而DON处理动物在CD4+和CD8+T细胞区室均表现出广泛受损。DON显著降低了T细胞的增殖能力，表现为Ki-67+群体减少。通过CD107a表面动员测量的细胞毒性潜力以及细胞因子产生（IFN-γ、TNF-α）同样减弱，表明效应功能受到显著抑制。功能表型分析进一步证明了反应复杂性的部分侵蚀。单阳性群体（CD107+、IFN-γ+或TNF-α+）的减少程度较轻，而双阳性群体（CD107+IFN-γ+、CD107+TNF-α+、IFN-γ+TNF-α+）则显著耗竭，三阳性（CD107+IFN-γ+TNF-α+）细胞几乎被消除。这种层次性的功能损伤符合多功能T细胞反应对最佳病毒清除至关重要的原则。然而，单功能T细胞活性的部分保留维持了基础的抗病毒能力。
讨论
本研究系统阐述了代谢干预在CHIKV感染期间平衡病毒控制与组织保护方面的治疗潜力。结果表明，尽管糖酵解和谷氨酰胺分解抑制在体外可类似地抑制病毒复制，但只有通过DON进行的谷氨酰胺分解拮抗才能在体内提供显著的组织保护。值得注意的是，DON给药在几乎不改变全身病毒载量的情况下，诱导了肌炎的近乎完全缓解，有效地将炎症病理与病毒负荷解耦。DON的保护功效与其免疫抑制特性直接相关，这种特性矛盾地将其历史上不利的影响转化为甲病毒发病机制中的治疗优势。这些结果确立了谷氨酰胺代谢作为急性甲病毒感染免疫调节的潜在靶点。
宿主代谢通路通过提供能量和生物合成前体从根本上调控病毒复制，这在CHIKV以及其他多种病毒中得到证实。然而，无论是2DG还是DON给药均未抑制体内外周组织中的CHIKV复制，推测是由于其向感染部位的生物分布有限，这一点通过肌肉和足部组织中分子靶点Hk2和Gls2的表达未改变得以印证。相反，两种抑制剂，特别是DON，深刻重塑了CHIKV感染小鼠的脾脏免疫细胞组成和功能。这种差异敏感性与淋巴细胞活化和增殖对葡萄糖和谷氨酰胺的代谢依赖性一致。
免疫细胞在CHIKV感染期间介导病毒控制和驱动免疫病理方面具有双重作用。本研究表明，DON介导的谷氨酰胺分解抑制实现了对过度活化免疫反应（而非不可控的病毒复制）诱导的病理的治疗性缓解。具体而言，DON耗竭了病理启动髓系群体（包括巨噬细胞和单核细胞），并限制了CD4+和CD8+T细胞的活化和效应分化。重要的是，DON损害了病毒特异性多功能T细胞启动的建立，这轻微削弱了病毒控制和针对再感染的免疫记忆。然而，它保留了CD4+和CD8+T细胞中基础水平的单功能活性。这种残余的免疫力维持了必要的免疫监视，解释了观察到的在没有病毒爆发情况下的组织保护。虽然总体记忆T细胞池因DON而减少，但我们观察到TCM在该池中相对占主导。这是因为TCM主要依赖OXPHOS（氧化磷酸化）来维持其持久性，与TEM强大的蛋白质和生物合成需求相比，该代谢通路对DON的敏感性较低。需要指出的是，DON的免疫抑制作用可能是短暂的，归因于其短半衰期和代谢酶的持续周转。
值得注意的是，尽管2DG和DON都被证明在T细胞活化和功能中起关键作用，但它们表现出不同的组织保护谱。DON相对于2DG的优越治疗效果源于基本的免疫代谢原理。淋巴细胞活化不仅需要谷氨酰胺产生能量，更关键的是将其作为新生核苷酸和氨基酸生物合成的必需氮供体。这种代谢需求是DON相比2DG能更显著抑制T细胞增殖的基础。对谷氨酰胺剥夺的敏感性为急性自限性感染创造了一个治疗窗口。这一机制见解与在COVID-19和脑脊髓炎模型中的临床观察一致，其中代谢干预可缓解细胞因子风暴而不损害宿主防御。
我们的研究结果为谷氨酰胺酶抑制剂在CHIKV临床管理中的应用提供了机制基础，其中免疫病理抑制可保护肌肉和关节完整性，并可能预防CHIKV诱导的慢性关节炎。一个关键的局限性在于，我们的模型在成年小鼠中使用CHIKV毒株KC488650，仅诱导了急性、自限性感染伴轻微组织损伤，而无慢性关节炎病理。这限制了对DON如何影响适应性免疫记忆或复发性关节炎的扩展评估，从而限制了其向慢性病症的直接临床转化。此外，关于治疗潜力，DON历史上存在的胃肠道毒性仍然是临床应用的关注点，新一代谷氨酰胺酶抑制剂（如JHU083）被设计为特异性生物激活以最小化全身毒性。重要的是，上调的谷氨酰胺分解是病原体诱导炎症期间活化免疫细胞的一个共同代谢特征。谷氨酰胺酶抑制剂的瞬时性支持其作为免疫病理高峰期脉冲式干预的潜力，以平衡组织保护与全身免疫抑制风险。这种基于时机的、宿主导向的策略可能不仅适用于CHIKV，也适用于其他由相关虫媒病毒引起的急性免疫病理驱动性疾病。未来的研究应在不同模型（因病毒毒株、宿主年龄、性别和感染过程（急性与慢性）而异）中评估使用新一代抑制剂的脉冲式方案及其与抗病毒药物的联合使用，以优化其对病毒清除、持续存在和长期保护的效果。
