《Emerging Microbes & Infections》：Lactoferrin blocks orthopoxvirus entry via heparan sulphate and regulates host antiviral pathways
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本文系统揭示了母乳关键组分乳铁蛋白（Lactoferrin, Lf）通过双机制高效抑制正痘病毒（如牛痘病毒、猴痘病毒）感染：一方面，其N末端结构域竞争性结合宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs），阻断病毒吸附/进入；另一方面，通过调控宿主抗病毒通路，如下调促炎因子、上调TGF-β依赖的抗病毒信号通路，恢复TGFBI表达并激活下游MAPK/ERK和JAK2/STAT3信号级联，从而增强干扰素（IFN）产生及干扰素刺激基因（ISG）表达。在动物模型中证实其显著降低肺部病毒载量及病理损伤。该研究为开发安全、经济、可及的抗正痘病毒（尤其是猴痘病毒）的新型预防/治疗药物提供了重要科学依据。
临床母乳样本有效抑制VACV感染。
为评估母乳的广谱抗病毒潜力，研究人员建立了牛痘病毒（VACV）感染模型，使用了天坛株（vvTT）和Western Reserve株（vvWR）两个代表性毒株。从15名健康供体收集的母乳样本在总蛋白浓度为3 mg/ml时，显示出对VACV感染的显著抑制作用。一个代表性样本对vvTT和vvWR的半数有效浓度（EC50）均达到0.06 mg/ml，该样本可显著减少病毒诱导的细胞病变效应（CPE），并将感染性病毒滴度降低约3个数量级。免疫荧光（IFA）结果显示，经3.0 mg/ml样本处理的感染细胞中，病毒A27蛋白的产生几乎检测不到，为其强大的病毒复制抑制能力提供了有力证据。时间依赖性添加实验表明，其抗病毒活性主要在感染早期阶段发挥作用，在病毒暴露前2小时给予母乳可提供超过95%的保护。这些结果表明，母乳干扰了VACV生命周期的多个阶段，对阻断子代病毒粒子的产生有显著效果。
为鉴定母乳中发挥抗病毒作用的活性成分，研究人员在四种具有不同组织嗜性的细胞系中，系统筛选了15种母乳来源的生物活性成分的抗病毒特性。包括乳铁蛋白（Lf）、浓缩乳清蛋白（WPC）、骨桥蛋白（OPN）和乳脂球膜（MFGM）在内的四种蛋白质成分在5 mg/ml浓度下表现出超过90%的病毒抑制率。通过热变性、胰蛋白酶-EDTA消化和胰蛋白酶-TPCK消化灭活母乳成分，其抑制VACV感染的能力显著减弱，这表明热不稳定的蛋白质是抗病毒作用的主要介质。进一步的剂量效应曲线确定，乳铁蛋白是其中效力最强的成分，其对vvTT的EC50为0.02 mg/ml，对vvWR的EC50为0.07 mg/ml，效力比其他候选物高20至30倍。对多种母乳样本中乳铁蛋白浓度的定量显示，其占总蛋白含量的5%到10%，并且乳铁蛋白百分比与抗病毒效力之间存在双相关系，表明母乳中存在一个最佳乳铁蛋白百分比以实现最大抗病毒活性。
乳铁蛋白对正痘病毒表现出广谱的进入阻断作用。
研究人员通过多模式评估来表征乳铁蛋白的抗病毒效力。剂量反应分析表明，乳铁蛋白能以浓度依赖的方式抑制感染性病毒粒子的产生和病毒基因组复制。10 mg/ml的乳铁蛋白处理可抑制约99%的病毒感染。比较人源乳铁蛋白（hLf）和牛源乳铁蛋白（bLf）在不同感染情景下的EC50值，bLf的平均EC50比hLf低2.6倍，显示出更高的治疗指数（SI > 57.2），且即使在高的病毒感染复数下其抗病毒活性也未受影响。细胞毒性实验证实，在所有测试浓度下，乳铁蛋白均保持了超过90%的细胞活力。
将研究扩展到临床相关病原体，bLf对新兴的猴痘病毒（MPXV Clade IIb）也表现出强大的活性，其EC50为21.50 μg/ml。此外，针对基于美国马萨诸塞州MA001株（GenBank ON563414.3）构建的可进行完整复制周期的互补性MPXV系统，bLf同样有效阻断了MPXV-A9R-A24R-KO的复制，EC50为20.00 μg/ml。研究人员还构建了携带MPXV及相关正痘病毒关键表面膜蛋白的水泡性口炎病毒（VSV）假病毒，用以评估其广谱抗病毒效果。bLf能以剂量依赖的方式有效抑制MPXV-A35R假病毒进入细胞，EC50为17.23 μg/ml。相比之下，对携带MPXV-M1R的假病毒仅有部分抑制效果。一致地，bLf也能中和携带其他MPXV膜蛋白的VSV假病毒。作为对照，乳铁蛋白不抑制VSV的复制，确认了其抗病毒活性对正痘病毒进入的特异性。这些发现共同表明，乳铁蛋白具有干扰多种正痘病毒感染的能力，突显了其广谱抗病毒活性。
考虑到乳铁蛋白单药的有效性，研究人员评估了将其与FDA批准的tecovirimat或brincidofovir联用的效果。通过8×8剂量组合矩阵评估抑制率，并使用SynergyFinder 3.0通过零膨胀泊松模型分析，结果显示乳铁蛋白与brincidofovir（协同分数1.789）及tecovirimat（协同分数2.347）均呈现相加性相互作用。特别值得注意的是，亚治疗剂量的tecovirimat（0.2 μM）与乳铁蛋白（125 μM）联用，可以达到与tecovirimat单药治疗（1.2 μM）同等的疗效，显示出6倍的剂量减少潜力。这种相加性特征表明，乳铁蛋白的免疫调节特性可以补充其他抗病毒药物的作用而不产生重叠毒性，这对于防止免疫功能低下患者出现限制治疗的不良反应是一个关键优势。
乳铁蛋白通过结合硫酸乙酰肝素对病毒吸附发挥抑制作用。
由于牛源乳铁蛋白比人源乳铁蛋白表现出更显著的抑制效果，因此在后续实验中使用了bLf。牛痘病毒进入宿主细胞的过程可分为三个不同的阶段：病毒附着、半融合和病毒核心进入。时间依赖性添加实验旨在确定bLf最初抑制vvTT感染的阶段。在病毒进入阶段给予2.5 mg/ml bLf可显著抑制病毒进入，使病毒产量显著降低93%。由于病毒在4°C时不会内化到细胞中，研究人员进行了温度转换实验，以探究乳铁蛋白在病毒进入机制中的具体作用。结果表明，bLf在病毒附着和内化阶段均能抑制vvTT，但对病毒吸附的影响更为显著。复制动力学和释放动力学分析阐明了bLf在病毒进入宿主细胞后的作用。在感染复数（MOI）为0.01时，vvTT在感染后4小时（hpi）开始复制，随后在12 hpi释放子代病毒粒子。与tecovirimat相比，bLf主要在病毒的预组装阶段发挥作用，导致细胞内的病毒拷贝数减少相对较小。上述发现表明，乳铁蛋白以剂量依赖的方式抑制病毒吸附，其主要作用机制可能与细胞表面附着因子有关。
附着阻断实验显示，与细胞预孵育的bLf可有效抑制vvTT的吸附。虽然具体的正痘病毒进入受体尚未明确，但已知糖胺聚糖是普遍存在的细胞表面因子，可促进病毒对宿主细胞的粘附。硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素有助于病毒的初始粘附，而层粘连蛋白则作为桥接配体促进病毒粒子附着于宿主细胞。为了阐明附着因子在乳铁蛋白介导的抗病毒活性中的作用，研究人员在细胞培养基中补充了GAGs。在没有HS存在时，250 μg/ml的乳铁蛋白对vvTT表现出约90%的抑制率，而外源性添加的HS会逐步减弱其抗病毒活性，表明存在竞争性静电相互作用。有趣的是，过量的HS增强了病毒的抑制作用，这表明过量的游离肝素可能直接干扰病毒对HSPGs的附着。研究人员还将分析扩展至GAGs家族的其他成员。与HS类似，外源性给予的CS和DS也表现出固有的抗病毒活性，但它们在抵消乳铁蛋白抗病毒活性方面不如HS有效，这表明HS在乳铁蛋白-正痘病毒相互作用中具有优先作用。差示扫描荧光法（DSF）证实了Lf与HS之间存在直接的相互作用，Lf的熔解温度（Tm）随HS浓度呈剂量依赖性增加。
为了从功能上验证HSPGs是vvTT进入因子，研究人员采用了互补的酶学和化学方法。HSPGs由一个核心蛋白聚糖蛋白和共价连接的HS链组成。氯酸钠（NaClO3）可减少乙酰化硫酸乙酰肝素的硫酸化，它能剂量依赖性地减少vvTT的结合。用三种在不同位点切割HSPGs的肝素酶处理，均减少了vvTT与细胞的相互作用，其中肝素酶I和III最为有效。此外，肝素酶预处理增强了乳铁蛋白的抗病毒活性，显示出协同效应。这些生化和功能数据共同确立了HSPGs是vvTT的主要附着因子。这表明，乳铁蛋白通过竞争细胞表面的HSPGs，阻止了vvTT的附着，从而减少了后续的病毒感染。
乳铁蛋白调控VACV感染的抗病毒先天免疫反应。
为了研究乳铁蛋白抗病毒活性的分子机制，研究人员在VACV感染后，对有或无bLf处理的HeLa细胞进行了RNA测序（RNA-seq）。qPCR分析证实了病毒感染的有效性以及乳铁蛋白介导的抗病毒效果。比较转录组分析显示，相对于vvTT感染的对照组，乳铁蛋白处理引起了显著的基因表达变化，共鉴定出4,131个差异表达基因（DEGs）（其中1,062个上调，3,069个下调）。对关键转录因子（p53、c-Fos、c-Jun、EGR1）的验证证实，乳铁蛋白不仅能轻度诱导其表达，还能将VACV诱导的过度激活恢复正常水平。与已发表的MPXV感染数据集的比较分析揭示了乳铁蛋白对这些正痘病毒-宿主转录界面的保守调控作用。利用KEGG和基因本体（GO）数据库进行的通路富集分析表明，先天免疫通路受到显著调控，特别是MAPK和TNF信号级联，同时还富集了参与粘着斑、肌动蛋白细胞骨架调控和中性粒细胞胞外陷阱形成的基因。值得注意的是，VACV感染强烈上调了多种促炎介质，包括趋化因子、细胞因子和生长因子，这些因子已知可促进病毒复制。乳铁蛋白处理有效地逆转了这些感染诱导的转录变化，并额外上调了包括BGN、GSN、TAGLN和TGFBI在内的多个基因。
在已鉴定的基因中，TGFBI作为一个对病毒反应特别敏感的目标出现，其在VACV感染期间表达受到抑制，但在乳铁蛋白处理后显著恢复。由于TGFBI是TGF-β信号通路的下游效应分子，研究人员推测观察到的TGFBI上调可能反映了乳铁蛋白介导的TGF-β依赖性抗病毒反应的激活。功能实验发现，通过siRNA敲低TGFBI可显著增强VACV的复制，证明TGFBI对细胞抗病毒反应至关重要。相应地，使用TGF-β信号通路激动剂SRI-011381处理，能以剂量依赖的方式抑制vvTT感染，从药理学角度支持了该通路的保护作用。这些互补实验从遗传学上验证了TGFBI在宿主防御正痘病毒中的重要性。
鉴于TGF-β信号通路与抗病毒通路（MAPK/ERK、JAK/STAT和NF-κB级联）之间的联系，研究人员进一步探究了其潜在机制。Western blot分析显示，VACV感染抑制了ERK和STAT3的表达，这作为一种免疫逃逸策略。乳铁蛋白处理有效地恢复了这些蛋白的水平并增强了其磷酸化。为了确定MAPK激活是否有助于进入抑制，研究人员探索了已知的MAPK通路激活剂茴香霉素的抗病毒作用阶段。虽然茴香霉素在病毒进入后处理可显著降低病毒复制，但在病毒进入阶段添加时则无抑制效果。这一结果表明，乳铁蛋白强大的进入阻断活性很可能是通过MAPK非依赖的机制介导的，而MAPK信号通路可能在进入后的抗病毒效应中发挥作用。为了进一步表征乳铁蛋白的抗病毒机制，研究人员进行了qPCR分析和双荧光素酶报告基因检测。乳铁蛋白能剂量依赖性地诱导I型和III型干扰素的表达，并激活干扰素刺激反应元件（ISRE）启动子，这与增强的抗病毒信号一致。利用分子特征数据库（MSigDB）基因集对干扰素刺激基因（ISG）表达的分析显示，与细胞对照相比，乳铁蛋白处理上调了包括CFH、TENT5A、IFITM1、TRAFD1、CCL2和PLA2G4A在内的多个ISG。层次聚类表明，Lf处理建立了一个与感染条件不同的、独特的ISG表达特征。这些发现共同表明，乳铁蛋白通过TGFBI-TGF-β信号轴增强了抗病毒防御。乳铁蛋白处理恢复了TGFBI的表达，并激活了下游的MAPK/ERK和JAK2/STAT3级联反应，从而导致了干扰素和ISG的产生。这一信号级联有助于抵消VACV诱导的免疫抑制，并在宿主细胞中建立抗病毒状态。
乳铁蛋白在体内对VACV感染表现出治疗效果。
研究人员在VACV感染的小鼠模型中评估了bLf的治疗效果。病毒对照组表现出明显的体重减轻和临床症状。感染后第5天的分析显示，bLf和tecovirimat处理使肺组织中的病毒基因组拷贝数减少了约3×106拷贝/克，感染性病毒滴度从1.45×105PFU/克降低至4.71×104PFU/克。此外，bLf给药适度缓解了体重减轻，并使平均临床病理评分从6.50降低至3.50。H&E染色显示，病毒感染组的肺组织出现广泛的坏死区域，伴有支气管和肺泡结构的破坏，表现为无定形的嗜酸性物质。可见坏死细胞碎片，血管周围间质水肿，结缔组织疏松排列，以及粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的显著浸润。在乳铁蛋白或tecovirimat处理的小鼠肺部，嗜酸性粒细胞计数和免疫细胞浸润减少，突显了乳铁蛋白对肺健康的保护作用。此外，乳铁蛋白通过降低肺组织中感染性病毒粒子的负担表现出保护功效，这证实了乳铁蛋白在体内能阻断正痘病毒的进入。病毒A27L蛋白的免疫组化（IHC）分析显示，与PBS对照组相比，tecovirimat和乳铁蛋白处理组的病毒抗原阳性细胞显著减少，这与qPCR和噬斑实验观察到的残留病毒基因组和感染性病毒粒子相一致。这些发现证实了乳铁蛋白对vvWR在小鼠体内的抑制作用和治疗潜力，表明其可用作临床干预手段。
