《Autophagy》：Duloxetine ameliorates cerebral ischemic injury by inhibiting autophagy
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本文创新性地从自噬调控角度探索缺血性脑卒中治疗新策略。研究团队构建高通量筛选平台，从898个化合物库中鉴定出已获FDA批准的抗抑郁药度洛西汀(Duloxetine)为新型自噬抑制剂。机制研究表明，其通过抑制TRPM2离子通道发挥神经保护作用，显著减小光血栓(PT)模型小鼠的脑梗死体积并改善运动功能，在年轻、老年及转基因小鼠(atg5cKO)模型中均得到验证。该工作为脑卒中提供了全新的药物再利用(repurposing)候选方案及潜在治疗靶点。
ABSTRACT
缺血性脑卒中是一种以脑部血流减少、导致氧和营养供应短缺为特征的严重疾病。缺血期间，脑梗死周围的神经元会启动巨自噬(macroautophagy)，但其对神经元存活的影响仍存争议。本研究旨在通过构建稳健灵敏的筛选平台，从生物活性化合物库中识别新的自噬调节剂，以期理解自噬在脑缺血中的作用，并为开发创新治疗策略奠定基础。
Introduction
缺血性脑卒中是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。尽管急性卒中管理有所进展，但溶栓和机械取栓等现有治疗方案仍有诸多局限，且治疗时间窗狭窄。巨自噬（文中简称自噬）是一种高度保守的细胞降解和回收过程，在缺血性卒中背景下，自噬会因能量耗竭和细胞应激（如兴奋性毒性、氧化应激和炎症）而被迅速激活。自噬的诱导通过清除受损细胞器为能量生产提供必需底物来促进细胞存活，但越来越多的证据也表明，过度或持续的自噬可能导致神经元损伤和细胞死亡，从而加剧缺血性损伤。因此，理解自噬的平衡对于开发脑卒中的靶向治疗策略至关重要。本研究旨在建立筛选平台，在模拟卒中条件下识别选择性靶向自噬途径的化学调节剂。
Results:
In silico pharmacokinetic analysis to improve drug screening of CNS-active compounds
研究首先对包含6839个化合物的商业小分子库进行了计算机药物代谢动力学(DMPK)分析，基于与药物相似性和中枢神经系统(CNS)穿透及活性相关的分子描述符进行预测和筛选。经过两轮计算机筛选，最终从原始库中选出898个生物活性化合物（占库的13.13%）进行后续生化评估，其中超过350个分子是FDA已批准的药物，这符合经典的药物再利用策略。
Chemical screening identified novel autophagy modulators
研究团队建立了基于Neuro-2a细胞自噬流监测的初级筛选实验，利用了串联荧光蛋白标记的LC3报告基因pHluorin-mKate2-human LC3 (PK-hLC3)。通过流式细胞术评估了自噬流的变化，并使用氧糖剥夺(OGD)来模拟卒中条件下的缺氧和营养剥夺。在898个测试化合物中，筛选出22个候选分子，其中7个在缺血/再灌注(I/R)条件下激活自噬流，15个抑制自噬流。已知的自噬抑制剂ULK-101和奎纳克林(quinacrine)也被筛选出来作为对照，未进一步研究。
Experimental validation of pre-screened chemical candidates
对筛选出的化合物在原始Neuro-2a细胞中进行了验证，通过Western blot检测LC3-I向LC3-II的转换。与巴弗洛霉素A1(Baf)共孵育时，NU7441、度洛西汀、ONC212、波齐替尼(poziotinib)或bedaquiline显著降低了LC3-I向LC3-II的转换。在无Baf情况下，MK-8745和Dp44mT增加了LC3-II转换。值得注意的是，单独使用度洛西汀处理显著降低了LC3-II水平。通过透射电镜(TEM)对自噬囊泡(AVs)进行分析确认了上述结果，例如NU7441与Baf共同处理显著减少了AVs的数量和大小，而度洛西汀、ONC212和波齐替尼与Baf共同处理则导致AVs肿胀，表明其内积累了未消化的物质。
Neuronal validation of autophagy inhibitors
在原代神经元中验证候选化合物。在营养剥夺(ND)条件下，NU7441抑制了自噬流，而度洛西汀和ONC212增加了LC3-II水平。然而，度洛西汀处理导致自噬底物SQSTM1/p62积累，表明其损害了自噬流的进程，但未影响神经元存活。在脑内皮细胞和星形胶质细胞中，OGD引起的自噬激活有限，度洛西汀对内皮细胞自噬标志物影响不显著，但可能抑制星形胶质细胞的自噬流。
TRPM2 inhibition affects autophagy
由于度洛西汀可抑制神经元中ADP-核糖诱导的TRPM2 (transient receptor potential cation channel subfamily M member 2)通道，研究假设TRPM2抑制可能介导了度洛西汀对自噬的影响。实验证实TRPM2在Neuro-2a细胞、原代神经元及小鼠脑组织中均有表达。使用两种TRPM2阻断剂ACA和2APB处理OGD条件下的Neuro-2a细胞，可增加SQSTM1/p62+囊泡的数量，且与度洛西汀共处理不会进一步增强此效应，表明抑制TRPM2足以模拟度洛西汀对自噬流的阻断作用。
Activation of autophagy after ischemic stroke
在小鼠光血栓(PT)远端缺血模型中，自噬流在卒中后被激活。在卒中诱导后24小时和72小时，缺血同侧半球（而非对侧半球）的LC3-II蛋白表达增加，证实了在缺血性损伤后中枢神经系统中自噬流增强。
Protective effects of duloxetine on brain injury in the photothrombotic distal model
接下来测试了自噬抑制剂在卒中模型中的治疗效果。DNA-PK抑制剂NU7441在PT模型小鼠中未能减少梗死体积。而度洛西汀的治疗（卒中诱导后10分钟开始，每日两次腹腔注射，总剂量20 mg/kg/天）则显示出显著的神经保护作用。在年轻雌性小鼠中，度洛西汀治疗三天后显著减少了TTC染色显示的梗死体积，Nissl染色在独立队列中也验证了这一保护作用。重要的是，即使在缺血发作后延迟4小时给药，度洛西汀仍能保留脑组织。在1岁龄老年雄性小鼠中，度洛西汀同样有效减少了缺血面积。在年轻和老年卒中小鼠中，度洛西汀都减少了梗死周围区域的GFAP+活化星形胶质细胞的数量。在皮质提取物中，度洛西汀增加了LC3-I向LC3-II的转换，并增加了SQSTM1/p62水平，但不调节BECN1，并且在缺血对侧（而非同侧）提取物中降低了磷酸化RPS6KB/p70S6K水平。在年轻雄性小鼠中，度洛西汀治疗略微改善了平衡木测试的运动协调性，并显著减小了TTC染色显示的缺血体积。透射电镜分析显示，在度洛西汀治疗的小鼠中，含有至少一个自噬囊泡元素的神经元细胞百分比更高。早期自噬抑制剂3-MA的脑室内注射也减少了PT模型小鼠的缺血体积。这些结果表明，在PT小鼠中早期抑制自噬可以发挥神经保护作用并减少缺血性脑损伤。
Inactivation of autophagy in SLC17A6/Vglut2-expressing neurons protects mice from PT stroke
研究采用非药理学方法，通过基因工程手段在兴奋性神经元中条件性敲除Atg5基因来调控自噬。将携带可条件敲除Atg5等位基因的小鼠与在Slc17a6/Vglut2基因调控区下游表达ires-Cre的小鼠杂交，获得在兴奋性皮质神经元中缺失ATG5的atg5条件性敲除(atg5cKO)小鼠及其对照。在30日龄时诱导PT卒中，结果显示，atg5cKO小鼠缺血同侧皮层中MAP1LC3/LC3免疫反应性低于对照小鼠。在卒中诱导3天后，Nissl染色评估显示，atg5cKO小鼠的缺血面积显著减少。GFAP染色也显示atg5cKO小鼠中GFAP+细胞减少，进一步证实早期阻断自噬在脑缺血中具有保护作用。
