《Journal of Inflammation Research》：Melatonin Suppresses NLRP3 Inflammasome Activation via SIRT1-Mediated ETS1 Deacetylation to Attenuate LPS-Induced Pyroptosis in Alveolar Epithelial Cells
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本研究发现褪黑素（Melatonin）可通过激活受体MT2，上调SIRT1介导ETS1去乙酰化，进而抑制ETS1对NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）的转录激活，最终减轻LPS诱导的人肺泡上皮细胞（HPAEpiC）焦亡（Pyroptosis），为急性肺损伤（ALI/ARDS）的治疗提供了新靶点。
研究目的
尽管褪黑素已知可抑制多种细胞类型的焦亡，但其在肺泡上皮细胞中的作用和机制尚不完全清楚。本研究旨在利用脂多糖（LPS）处理的人肺泡上皮细胞（HPAEpiC）作为体外模型，探究褪黑素抗焦亡的分子机制。
研究方法
研究通过LPS刺激HPAEpiC细胞诱导焦亡。通过碘化丙啶染色评估细胞死亡，利用透射电子显微镜（TEM）观察细胞形态变化。通过蛋白质印迹和免疫荧光分析焦亡相关标志物，酶联免疫吸附试验（ELISA）测量炎症因子。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验和siRNA敲低技术，来确定褪黑素抑制焦亡所涉及的关键靶点和机制。
研究结果
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褪黑素抑制LPS诱导的HPAEpiC细胞焦亡
褪黑素显著降低了LPS诱导的HPAEpiC细胞焦亡。它能恢复LPS暴露细胞的活力，减少碘化丙啶（PI）阳性细胞数量，并减弱cleaved caspase-1（c-caspase-1）的荧光强度。蛋白质印迹分析显示，褪黑素下调了关键焦亡相关介质NLRP3、c-caspase-1和GSDMD-N的蛋白表达。ELISA实验表明，褪黑素显著抑制了细胞培养上清中促炎细胞因子IL-1β和IL-18的分泌。透射电镜观察发现，LPS处理导致细胞膜出现气泡和大孔，而褪黑素处理减轻了这些变化。
- 2.
褪黑素通过下调ETS1抑制HPAEpiC细胞焦亡
LPS处理升高了ETS1蛋白水平，而褪黑素共处理抑制了这种升高，并减少了ETS1的核积累。过表达ETS1在很大程度上逆转了褪黑素诱导的NLRP3、c-caspase-1和GSDMD-N蛋白水平的降低，以及IL-1β和IL-18的释放减少和PI阳性细胞比例的下降。这些数据表明，褪黑素通过下调ETS1来减轻LPS诱导的HPAEpiC细胞焦亡。
- 3.
ETS1通过直接调控NLRP3表达介导褪黑素的抗焦亡作用
LPS刺激显著升高了NLRP3的mRNA和蛋白水平，敲低ETS1可明显减弱这种升高。褪黑素处理同样降低了LPS刺激细胞中NLRP3 mRNA的上调。生物信息学分析在NLRP3启动子区域发现了两个潜在的ETS1结合位点。ChIP实验证实ETS1直接结合到这些启动子位点，并且LPS诱导的ETS1与NLRP3启动子结合增强可被褪黑素处理显著抑制。这些结果表明，ETS1通过直接结合NLRP3启动子并调控其转录，来介导褪黑素的抗焦亡作用。
- 4.
褪黑素通过SIRT1促进ETS1去乙酰化
在HPAEpiC细胞中，LPS暴露显著增加了ETS1的乙酰化，而褪黑素处理大大减弱了这种效应，表明褪黑素促进了ETS1的去乙酰化。使用去乙酰化酶抑制剂发现，Sirtuin家族去乙酰化酶参与其中。在测试的核内Sirtuin（SIRT1、SIRT6、SIRT7）中，siRNA敲低SIRT1（而非SIRT6或SIRT7）显著增加了褪黑素处理的HPAEpiC细胞中ETS1的乙酰化。内源性免疫共沉淀实验显示，褪黑素增强了ETS1与SIRT1之间的物理相互作用。这些结果表明，褪黑素特异地通过SIRT1促进ETS1去乙酰化。
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SIRT1介导的ETS1去乙酰化对褪黑素的抗焦亡效应至关重要
在褪黑素处理的HPAEpiC细胞中，敲低SIRT1导致核内ETS1蛋白显著积累，并伴随NLRP3 mRNA水平升高。ChIP分析显示，敲低SIRT1后ETS1与NLRP3启动子的结合增强。与单独敲低SIRT1相比，在SIRT1缺陷细胞中额外敲低ETS1，可显著减弱焦亡相关蛋白（NLRP3、c-caspase-1和GSDMD-N）的增加、PI阳性细胞比例的升高以及IL-1β和IL-18释放的增多。这些发现表明，SIRT1介导的ETS1去乙酰化是褪黑素抑制焦亡的关键机制。
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MT2介导褪黑素对SIRT1/ETS1/NLRP3轴的激活及焦亡的抑制
研究首先验证了HPAEpiC细胞中MT1和MT2的表达。敲低MT2（而非MT1）显著减弱了褪黑素诱导的SIRT1上调，以及ETS1的下调和去乙酰化。因此，敲低MT2逆转了褪黑素对焦亡的抑制作用，表现为细胞活力下降，NLRP3、c-caspase-1和GSDMD-N蛋白水平升高，IL-1β和IL-18释放增加，PI阳性细胞比例上升。这些结果表明，MT2（而非MT1）对于褪黑素介导的SIRT1/ETS1/NLRP3通路激活及随后的焦亡抑制是必不可少的。
结论
本研究揭示了褪黑素缓解焦亡的分子机制，并确定了一个介导其抗焦亡作用的具体信号通路。研究证明，MT2是HPAEpiC细胞中激活的主要褪黑素受体亚型。MT2激活后，SIRT1使ETS1去乙酰化，从而抑制NLRP3炎症小体的激活。这些发现共同表明，褪黑素通过MT2/SIRT1/ETS1/NLRP3轴抑制LPS诱导的HPAEpiC细胞焦亡。该研究不仅阐明了褪黑素抗炎作用的新机制，也凸显了其对炎症相关肺部疾病的治疗潜力。
