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本研究探讨了天然化合物Obacunone（OB）在缺血性脑卒中（ischemic stroke）中的神经保护作用。研究发现，OB通过直接结合丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1/ERK2）的ARG-146位点，有效抑制小胶质细胞（microglia）介导的神经炎症（neuroinflammation），并下调下游MAPK/NF-κB信号通路，从而在体外和小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中减轻缺血性脑损伤、改善神经功能缺损与远期记忆恢复。该研究为OB作为治疗缺血性脑卒中的潜在药物候选物提供了新的机制依据。
缺血性脑卒中是中国第三大致死原因，神经炎症在其病理过程中扮演关键角色，而小胶质细胞是中枢神经系统内率先被激活的固有免疫细胞。Obacunone（OB）是一种从柑橘类植物中提取的单体化合物，已知具有抗炎、抗氧化和抗癌等多种药理活性。本研究旨在探究OB在缺血性脑卒中中的神经保护效应及其潜在分子机制。
在体外实验中，研究使用脂多糖（LPS）刺激原代小胶质细胞以模拟炎症状态。结果表明，OB在1-50 μM浓度范围内不影响细胞活力。OB预处理能以剂量依赖的方式，有效抑制LPS诱导的原代小胶质细胞中促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）的mRNA和蛋白表达水平。进一步的机制探索发现，OB能够抑制核因子κB（NF-κB）信号通路的激活，表现为降低磷酸化NF-κB p65（p-NF-κBp65）与总NF-κB p65的蛋白比值，并减少NF-κB p65的核转位。
在体内实验中，研究采用了小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型来模拟缺血性脑卒中。在MCAO手术后1、24和48小时，通过腹腔注射给予OB（5或10 mg/kg/天）进行治疗。短期评估显示，OB治疗显著减少了脑梗死体积，改善了血脑屏障通透性，并在一系列行为学测试中表现出对神经功能缺损的缓解作用，包括降低改良神经功能缺损评分（mNSS）、减少步态失误、增强抓握力以及延长转棒实验的潜伏期。通过对梗死周边脑组织的分析，证实OB处理同样降低了IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的表达，并且使活化的小胶质细胞形态向静息状态转变，表现为胞体减小、分支增多、端点增加以及最大和平均分支长度增长。
为了评估OB的长期疗效，研究将OB给药延长至MCAO后30天。长期行为学测试结果表明，OB治疗不仅持续改善了感觉运动功能，还在旷场实验和Y迷宫测试中促进了空间记忆的恢复，增加了中央区域探索时间和自发交替率。
为了阐明OB的作用靶点，研究综合运用了网络药理学、分子对接及生物物理验证技术。网络药理学分析预测了OB与缺血性卒中相关的85个交集靶点，其中丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1，即ERK2）在网络中处于核心枢纽位置。分子对接模拟显示，OB与MAPK1蛋白具有高结合亲和力（结合能为-8.68 kcal/mol），其关键结合位点为ARG-146和ARG-170。表面等离子共振（SPR）实验进一步证实了OB与纯化MAPK1蛋白的直接结合，平衡解离常数（KD）为2.57 μmol/L。细胞热位移分析（CETSA）和药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验均验证了OB与MAPK1在细胞内的直接相互作用。特别地，定点突变实验揭示，ARG-146位点是OB发挥抗神经炎症功能的关键位点，当该位点突变为丙氨酸（R146A）时，OB对MAPK1的结合稳定作用及其对LPS诱导的促炎因子（IL-6, TNF-α, COX-2, iNOS）表达的抑制作用均被取消。
在信号通路层面，研究发现OB处理能够抑制LPS刺激的原代小胶质细胞以及MCAO小鼠脑组织中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达水平，并减少ERK的核转位。由于MAPK/ERK通路是NF-κB通路的重要上游调控者，OB通过靶向结合MAPK1并抑制其活性，进而阻断了NF-κB信号通路的活化，最终实现了抗神经炎症和神经保护的效果。
综上所述，本研究系统阐明了天然化合物Obacunone通过直接靶向结合MAPK1蛋白的ARG-146位点，抑制MAPK/NF-κB信号通路，从而减轻小胶质细胞介导的神经炎症，并在MCAO小鼠模型中发挥神经保护作用、改善短期及长期神经功能预后的分子机制。这些发现不仅深化了对OB药理作用的认识，也为其作为治疗缺血性脑卒中的潜在新型治疗剂提供了重要的临床前实验依据。研究的局限性包括未设置阳性药物对照组、实验对象仅为青年雄性小鼠，以及尚未在卒中前给予OB进行预防性研究，这些都需要在未来进一步探索。
