《Journal of Oral Microbiology》：Interrogation of imaging-based interspecies dynamics in the oral microbiome
口腔是一个极为复杂的动态环境，栖息着近千种细菌、病毒、真菌、古菌和原生动物。在这个微生态系统中，微生物之间的相互作用深刻影响着微生物群落的结构与功能，其空间组织和生物地理模式与健康或疾病状态紧密相关。传统的、仅关注群落组成的研究方法，已不足以理解这些复杂的相互作用。本篇综述聚焦于基于成像的技术，结合多组学分析与人工智能方法，为我们理解口腔微生物组的空间动态和功能提供了一个更为整合的视角。
1. 新型荧光成像技术揭示高度结构化的口腔微生物群
微生物在口腔内的分布并非随机，而是呈现异质性和非随机的空间组织。从牙齿、牙槽黏膜到舌背，不同的微生物栖息地形成了从前到后的生态梯度。微生物并肩生活、层层堆叠、相互交织，形成复杂的相互作用群落。例如，人类舌背上密集且高度结构化的微生物聚集体显示出类克隆扩张的类群聚集。
成像技术，特别是与先进光学系统（如超分辨率显微镜或共聚焦激光扫描）结合的荧光成像，极大地增强了我们在原位理解动态微生物组织和量化相互作用的能力。这些技术揭示了不同微生物类群彼此之间以及相对于宿主表面的排列方式。牙菌斑、舌背和角化牙龈的微生物群彼此差异最为显著。
物种水平的成像技术，如组合标记和光谱成像-荧光原位杂交（CLASI-FISH），揭示了舌背上特定物种的优势地位，支持了大多数口腔微生物是“部位专家”的测序证据。CLASI-FISH也被用于研究牙菌斑生物膜，表明马氏棒杆菌（Corynebacterium matruchotii）可能在生物膜基底与其外层之间扮演着重要物理桥梁的角色。有趣的是，多重免疫组化显示，在龋坏牙本质内，真菌和细菌大多占据独立的牙本质小管，很少共定位，这可能部分反映了它们直接物理相互作用的可能性有限。
在中尺度分析层面，微生物结构受细胞外信号和生物物理特性的调控，包括化学梯度（营养、氧气、抗菌剂），这些梯度既决定也受细胞间相互作用以及细胞与环境之间的相互作用所塑造。此类方法凸显了微生物“热点”的存在，此处的局部相互作用（如代谢物交换或竞争性抑制）可能在群落组装和功能塑造中起关键作用。在纵向样本中，研究人员观察到反复出现的、独特的微观结构，例如劳特罗普氏菌（Lautropia）细胞簇，表明口腔微生物组的空间结构可以随时间保持稳定。
在牙菌斑中，棒杆菌（Corynebacterium）细胞像树一样为其他细菌创造栖息地，一些与细丝尖端结合，例如链球菌（Streptococcus spp.），使其可以直接接触到口腔环境（如唾液），形成特征的“玉米棒”结构；另一些则可能嵌在生物膜团块更深层，那里是它们所需的、更受庇护的低氧环境。这种空间组织使每个微生物参与者能够与多个（尽管有限）潜在伙伴相互作用，被认为促进了群落的长期稳定性。另一项关于多物种生物膜的研究显示，变形链球菌（Streptococcus mutans）密集地聚集在“圆形”细胞外支架中，创造了局部低pH区，导致牙釉质脱矿，这提示空间结构与龋病发生存在可能的联系。
高系统发育分辨率荧光原位杂交（HiPR-FISH）进一步揭示了口腔菌斑样本中罗氏菌（Rothia）和拟杆菌（Phocaeicola）细胞的共定位，暗示了潜在的代谢协同作用。牙科植入物生物膜中的空间分析同样揭示了与疾病相关的结构特征，表现为生态系统不稳定：细菌大量繁殖形成大片斑块，由于关键功能角色的缺失，创造出开放生态位，使得新的或机会性存在的群落成员得以定植。这支持了种植体周围菌群失调的模型，该模型假设改变的生物膜空间结构促进了病原体定植。
通过整合共聚焦活细胞成像和计算图像分析，有研究证明，唾液链球菌（S. sputigena）细胞与变形链球菌衍生的胞外多糖（EPS）α-葡聚糖共定位，表明变形链球菌可能促进了能动菌新月形单胞菌（Selenomona）的定植和生物膜形成。此外，利用动态追踪的流动池微流控技术捕获实时成像，研究人员在患有严重龋病的儿童唾液中，观察到白色念珠菌（Candida albicans）和变形链球菌具有高度结构化排列的天然跨界聚集体，它们表现出协调的“跳跃样”和“行走样”运动并持续生长，这是一种独特的迁移空间运动形式，促进了生物膜的快速扩张，并可能加剧龋病。
在更精细的尺度上，最近的进展使得单细胞分辨率成像成为可能。例如，使用Airyscan的超分辨率共聚焦成像，在患有活跃性龋病的儿童唾液中，检测到跨界聚集体内细菌和真菌表面的α-葡聚糖，突出了与早期儿童龋病相关的复杂细菌-真菌-EPS生物结构。然而，在大多数情况下，密集堆积的生物膜阻碍了对单个细胞及其相互作用的分析。异向性膨胀显微镜通过将微生物群落连接到可膨胀的聚电解质凝胶，同时保持细胞自身不膨胀，解决了这一挑战。凝胶的各向同性膨胀使细胞分散，增强了传统显微镜的空间分辨率，提供了前所未有的微生物异质性视图。这种改进的空间细节揭示了物种水平的特异性相互作用；例如，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）对血链球菌（Streptococcus sanguinis）的粘附性强于对变形链球菌，表明可能影响群落组装的特定偏好。
尽管取得了显著进展，微生物组成像仍从根本上受限于复杂的微生物群落和光谱可区分荧光团的数量有限。顺序FISH方法可以显著扩展多重检测能力，纠错策略可以进一步提高靶标识别准确性，从而实现口腔微生物群落更精细分辨率的空间图谱绘制。
2. 基于成像的空间多组学解码空间组织与种间相互作用
代谢物作为生物膜内的营养货币和通讯信号，实现交叉喂养和集体恢复力。它们还通过脂多糖和肽聚糖触发炎症，或通过来自牙周袋中常见的牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas）和具核梭杆菌的色氨酸衍生物和短链脂肪酸促进免疫耐受，从而调节宿主反应。然而，研究复杂群落中代谢物的传统方法主要依赖于批量提取和分析，这会破坏样本并消除空间背景。这些方法对不同细胞种群和微环境中的信号进行平均，掩盖了生物膜内空间组织的关键代谢异质性和相互作用。相比之下，新兴的基于成像的空间多组学工具允许在完整的微生物群落内直接可视化和量化代谢物分布。
为了理解代谢物如何在口腔内介导种间相互作用，在完整群落内解析其空间分布和细胞特异性活性至关重要。拉曼光谱（RS）是一种利用拉曼效应的振动光谱技术，可以在单细胞分辨率下检测和绘制代谢物图谱。来自不同致龋链球菌生物膜的拉曼光谱显示，每个物种产生独特的光谱特征，尤其是在脂质、酰胺蛋白和碳水化合物对应的区域。值得注意的是，受激拉曼散射（SRS）显微镜等最新进展已在活细胞和组织中实现了亚微米分辨率和视频速率的成像速度。例如，在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜中，利用SRS成像碳-氘键，以高空间分辨率可视化生物膜深度上分层的代谢活性，揭示了缺氧子区域中吩嗪依赖的生物合成热点。此外，拉曼光谱标记物可以作为生物膜对治疗反应的指标，并检测特定的代谢物驱动相互作用，例如在用季铵硅烷处理富含变形链球菌的牙科生物膜时观察到的拉曼峰降低，从而能够在抗菌治疗期间实时监测生物膜分解。利用原位拉曼微探针，观察到牙龈卟啉单胞菌在抗菌生物陶瓷表面产生过氧亚硝酸盐，为了解生物膜内特定位置的氧化应激化学提供了见解。这些观察结果突出了局部化学活性，但在没有遗传或生化操作的情况下无法确定因果关系。
表面增强拉曼散射或光谱（SERS）是一种结合纳米技术和生物医学的强大技术，利用等离子体金属纳米结构以超高灵敏度（甚至在单分子水平）检测分子指纹。具有密集Au-SiO2-Au纳米间隙“热点”的纳米层状等离子体晶体（NLPCs）能够对活体丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）生物膜在噬菌体感染下的动态生化变化进行高灵敏度实时监测。该平台捕获了动态生化变化，揭示了病毒剂量依赖性的生物膜破坏、细胞裂解和病毒复制期间的宿主代谢转变。类似地，基于SERS的纳米等离子体平台可用于监测口腔链球菌-韦荣球菌（Streptococcus-Veillonella）相互作用的时空动态，实现代谢交换（如乳酸消耗、短链脂肪酸产生）和生物膜在治疗或生态扰动下发展的实时可视化。
口腔环境中的种间和种内相互作用通常涉及多样化的、非靶向的代谢物或信号分子，需要广泛的、发现驱动的代谢景观图谱，这超出了拉曼光谱所能达到的分子覆盖范围。基质辅助激光解吸/电离成像质谱（MALDI-IMS）通过在一次扫描中直接从生物表面同时检测和绘制数百到数千个分子，而无需标记或靶向，满足了这一需求。通过在样本上进行光栅扫描，MALDI-IMS在每个像素点生成质谱，可以通过计算重建为离子图像，显示特定峰值在样本表面的强度。与传统破坏空间背景的检测方法不同，MALDI-IMS保留了分子分布的完整性，提供无标记、空间分辨的代谢组学谱图。在口腔癌中，MALDI-IMS识别了局部生物标志物，如口腔鳞状细胞癌中的LRP6，证明了其空间解析能力，但未阐明功能因果关系。
借鉴癌症诊断经验，MALDI-IMS也被探索用于理解生物膜中的空间化学。研究人员监测了恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）生物膜发育过程中N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）的产生，证明了AHL信号在早期阶段的均匀分布。随着生物膜成熟，AHLs转变为代谢物（如喹诺酮类和铁载体）在边缘的积累，这与扩展边缘的集群运动性相关。此外，高分辨率MALDI或后电离等先进仪器能够绘制竞争性相邻细菌菌落之间交换的种间代谢物图谱。脉冲红外（IR）-MALDI-IMS显示，在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌的共培养中，独特的群体感应分子在直接接触区强烈上调和集中，一个菌落产生的分子扩散到另一个菌落的区域。这些微生物代谢的空间解析见解与口腔生物膜直接相关，后者也表现出对抗和合作的微米尺度区域，例如产酸链球菌物种邻近酸敏感共生菌，或念珠菌感染中的细菌-真菌界面。因此，MALDI-IMS可应用于牙菌斑或黏膜生物膜样本，以发现区分病原体微环境与健康相关微环境的代谢物，为下游功能验证提供假设。
在此基础上，新兴的多模式平台进一步提高了空间分辨率和分子鉴定能力。先进技术，如空间代谢组学流程（metaFISH），结合了MALDI-IMS和荧光显微镜，将化学与微生物身份联系起来。通过在同一个组织切片上叠加MALDI图谱和FISH，metaFISH能够在微米到单细胞分辨率下同时可视化代谢物和微生物类群的空间分布。利用这种方法，在单个上皮细胞尺度上解析了深海贻贝及其胞内共生细菌的空间代谢组，展示了定义共生微生态位的代谢物交换模式。应用于口腔系统，metaFISH可以绘制牙菌斑或黏膜生物膜内的代谢物梯度和微生物定位。这种能力对于通过直接将物理微生物关联与局部代谢活动联系起来，剖析物种特异性相互作用和细菌共聚集模式尤为重要。值得注意的是，口腔生物膜内涉及益生菌株的共聚集已被认为是菌群失调和生物膜免疫原性的重要因素，这强调了我们需要理解空间组织和局部代谢微环境如何在原位介导益生菌功能。通过同时可视化细菌菌株、其共聚集伙伴以及相关的代谢特征，metaFISH可以通过阐明益生菌融入口腔生物膜如何调节群落代谢、宿主相关代谢物和炎症潜力来填补这一空白。更广泛地说，这种方法可以揭示物种特异性的代谢相互作用，识别基于代谢物的生物标志物，并监测抗菌或益生菌干预对口腔代谢稳态的影响。总之，这种整合的成像框架在剖析口腔生物学中的微生物-宿主和微生物-微生物相互作用方面具有强大潜力。
拉曼光谱、MALDI-IMS和metaFISH是互补的工具，可以实现前所未有的原位代谢物可视化。这些空间多组学方法共同使研究人员能够可视化口腔微生物群落的化学结构；事实上，我们可以检测酸产生的位置，显示信号分子集中的位置，以及所有这些化学因素如何与微生物组织排列；然而，这些数据仍然是相关性的，没有互补的功能验证无法揭示机制性相互作用。
3. 人工智能和计算技术革新微生物组研究的空间结构
基于成像的检测现在常规产生太字节级别的多通道、三维数据，因此提取生物学意义越来越依赖于专门构建的分析流程，而非手动检查。机器学习框架被证明尤其强大。博罗瓦等人探索了使用多示例学习（一种处理分组未标记数据的机器学习方法）从混合培养显微图像中进行细菌物种分类，绕过了耗时的纯培养制备需求。这种方法能够在复杂微生物群落中实现更快、更可解释的诊断。哈姆等人（2024年）采用空间分辨成像（HiPR-FISH）可视化口腔生物膜的生态结构，展示了种植体周围炎中的致病菌群如何形成紧密聚集的生态位。
基于成像的空间多组学正在革新微生物组研究，通过提供对微生物群落与其宿主环境之间相互作用的直接洞察。空间宿主-微生物组测序（SHM-seq）是一种与深度学习紧密结合的全测序方法。它通过修饰空间条形码玻璃表面，直接从组织中捕获组织、多聚腺苷酸RNA和细菌16S rRNA，实现了细菌16S rRNA和宿主转录本的同时捕获。我们建模这些复杂空间结构的能力随着人工智能辅助工具和机器学习技术的出现而显著提高。例如，系统发育多路径卷积神经网络（PM-CNN）利用微生物的多层层次聚类对系统发育关系进行建模，从而提供更准确的基于微生物组的疾病预测。基于密度的无监督机器学习技术可以专注于空间聚类。整合多种数据流的不同多组学方法产生了海量且复杂的数据源。新开发的、受生物学启发的、多尺度人工智能建模框架可能为理解空间结构带来新的认知水平。
此外，独特的口腔生态环境，具有唾液流动、黏膜表面和牙齿结构等多种生态位，产生了高度复杂的成像数据集。这些复杂性凸显了需要先进的人工智能应用来整合和解释来自此类异质性来源的数据。派斯等人开发了使用自动化机器学习技术的预测模型，以整合来自唾液和龈下生物膜的数据集。他们的方法识别了聚类微生物物种的组合来预测种植体周围炎。同样，赵等人使用深度学习模型PSPNet（一种用于图像分割的模型）来捕捉超越单个类群的复杂微生物模式。该方法可以处理复杂数据集，捕捉详细背景，并为疾病诊断提供口腔微生物组的全面评估。
尽管人工智能在口腔微生物组研究中前景广阔，但这些模型的效用在很大程度上取决于数据质量、多样性和可解释性。许多研究报告了较高的预测准确性，但样本量限制、队列多样性和缺乏实验验证制约了其转化相关性。正如几项先前研究指出的，使用了不同的指标来评估模型性能。例如，丁等人使用皮尔逊相关系数来评估预测结果与观察结果之间的一致性。赵等人报告了较低的平均绝对误差，以证明预测准确性以及计算效率。重要的是，派斯等人报告了高灵敏度，在唾液样本中高达95%，但分类性能的特异性相对较低。为确保人工智能生成的预测反映真实的生物学现象，互补的体外实验和体内研究（例如动物模型或临床队列）是必不可少的。宿主反应和空间微生物组织的整合进一步强调了实验验证的必要性。
4. 早期诊断的潜在生物标志物和重塑微生物动力学的治疗策略
口腔微生物组的治疗调节将取决于准确理解微生物群落如何随时间和空间动态变化，以及哪些种间相互作用是维持健康微生物组所必需的。为实现这一目标，结合生物地理学数据对于指导和完善研究口腔微生物生态学的代谢基础至关重要。
几种代谢物已被确定为菌群失调和疾病易感性的潜在生物标志物。例如，源自链球菌糖代谢的半乳糖利用，可能会改变牙龈卟啉单胞菌的生理机能，削弱其形成生物膜和与宿主组织相互作用的能力。戈登链球菌（S. gordonii）的代谢产物对氨基苯甲酸（PABA），通过改变胞外多糖组成和菌毛表达来调节牙龈卟啉单胞菌的毒力。丁酸盐是牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌（Tannerella forsythia）和具核梭杆菌产生的一种短链脂肪酸（SCFA），通过减少中性粒细胞吞噬作用和下调细胞间粘附分子（ICAM-1）在免疫抑制中发挥重要作用，从而促进牙周病中的慢性炎症。这些代谢物的空间分布为疾病进展提供了关键见解，并确定了靶向干预的机会。
鉴于代谢物在微生物动力学和宿主免疫反应中的关键作用，靶向关键代谢途径已成为口腔健康领域一种有前景的治疗策略。益生菌方法，如乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacteria）物种，可以调节乳酸代谢以抵消酸化并降低龋病风险。在牙周病中，罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）也被研究作为辅助疗法，新出现的证据表明其益生菌益处超出了对单个病原体（如具核梭杆菌）的直接拮抗作用，更广泛地重塑了生物膜组成和免疫原性。除了乳酸代谢，舌背和龈下菌斑中的口腔硝酸盐还原菌有助于硝酸盐-亚硝酸盐-一氧化氮途径，对一氧化氮生物利用度以及局部氧化还原和炎症平衡具有潜在影响。在此背景下，空间分辨代谢组学成像方法，如拉曼光谱、MALDI-IMS和metaFISH，可以通过连接生态位特异性定植与局部代谢梯度及宿主-微生物信号，直接评估益生菌潜力。
总的来说，这些发现凸显了一个概念转变，即通过精确调节微生物代谢作为恢复口腔稳态的手段。纳米材料，特别是那些产生或清除活性氧（ROS）的材料，因其双重能力——既能破坏致病性生物膜，又能减轻氧化应激——而受到探索。靶向特定代谢酶（如乳酸氧化酶或过氧化氢酶）的蛋白质疗法，也因其恢复氧化还原平衡和抑制病原体生长的潜力而受到研究。其中，酶功能化纳米颗粒作为一种突出疗法，结合了酶活性的精确性与纳米技术的稳定性和递送优势。这些系统可以降解有害代谢物，如丁酸盐或乳酸，同时调节微生物相互作用和免疫反应，为恢复口腔微生物平衡提供了一种多方面的方法。这种代谢策略和纳米技术的融合代表了向精准靶向疗法迈出的变革性一步，这些疗法不仅针对口腔疾病，还有潜力改善全身健康结果。
重要的是，这些靶向代谢策略的有效性与微生物群落的空间组织内在相关。代谢物梯度、微环境和宿主-微生物信号并非均匀分布，而是集中在空间结构内的局部微生物相互作用中。因此，治疗效果无法仅通过组成分析来完全捕捉，这强调了对反映功能和空间背景的评估框架的需求。虽然目前的口腔微生物菌群失调指数（如牙周指数）主要依赖于相对丰度的组成变化，但新兴的空间成像技术通过整合结构和基于邻近性的参数，为完善这些指标提供了机会。高重数荧光成像和分析可以解析稳态类群和失调类群之间的接触依赖性相互作用、生物膜深度梯度以及上皮界面接触，这些是测序无法捕捉的。这种整合了种间邻近性、垂直分层和组织侵入等空间描述符的方法，可以增强现有微生物指数的诊断和预后敏感性。类似的框架可以扩展到肿瘤学背景，其中肿瘤和邻近正常组织的整合空间多组学分析已开始揭示与口腔鳞状细胞癌相关的结构化微生物改变。通过将分类学指数与空间和宿主界面特征相结合，未来的研究可以更好地理解特定的微生物群落是作为被动生物标志物还是致癌微环境的主动贡献者。
结论与展望
研究微生物群原生空间结构与其功能之间的联系，需要保持微生物种群原始拓扑结构的采样策略。这种方法能够同时跨尺度可视化微生物和宿主结构。然而，传统的薄切片成像未能完全捕捉微生物群落的空间复杂性。替代性的低扰动工具，如带棱的塑料舌刮，可以回收保留空间组织的生物膜碎片，尽管采集过程中的压缩仍然是一个限制。最近的进展包括保持黏膜微生物群、宿主组织和脆弱黏液层空间完整性的组织透明化技术。尽管取得了这一进展，该方法尚未应用于口腔生物膜或整合到临床患者样本工作流程中，这需要进一步验证。
模拟原位微环境的体外模型已经出现，用于研究口腔微生物组内的空间相互作用。尽管短程因素（如直接粘附和陡峭的微米级梯度）对微生物生态位产生强大影响，但远程因素同样以复杂的方式塑造口腔生物膜组成。相隔数厘米的类群之间可能通过空气中扩散或通过唾液流输送的小分子发生相互作用。微生物种群的时空追踪同样为了解这些种间相互作用如何演变并随时间推动更广泛的微生物结构变化提供了进一步的见解。此外，与微流控技术相结合的器官芯片方法，能够实时表征模拟人类口腔条件（包括唾液流动和不同生态位）的体外模型中生物膜的形态、定植密度和空间排列。通过重建高分辨率三维或延时图谱，这些方法揭示了局部生态位如何在微观尺度上塑造微生物生态，最终影响从健康相关群落向疾病相关群落的转变。
然而，基于成像的研究结果具有固有的局限性。尽管技术进步，显微镜本质上仍然是描述性的，信号受到标记策略、光物理特性、采样/固定伪影、图像处理和下游分析流程的影响，使得结果容易受到混杂因素和偏差的影响。因此，需要靶向遗传或化学扰动、受控的体外实验以及体内或临床研究来验证观察结果并建立因果关系。
口腔内化学相互作用（如代谢物）的空间和功能特异性，突显了其作为诊断生物标志物和治疗靶点的双重潜力。空间代谢组学的进展揭示了位置特异性的代谢物，强调了微环境因素在塑造微生物相互作用中的重要性。口腔健康管理的未来在于精准微生物组调节，其中空间和功能上相关的代谢物既可作为早期疾病指标，也可作为治疗靶点，促进口腔微生物组的平衡。将人工智能驱动的分析与先进成像和多组学方法相结合，可以创建预测模型，模拟微生物相互作用、代谢物产生和宿主反应对群落稳定性和健康结果的影响，从而可以更准确地预测疾病进展并实现个性化治疗。
