《Journal of Oral Microbiology》：Macrophage activation and invasion by P. gingivalis is modulated by PPAD and accessory fimbriae subunits
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本研究深入探讨了牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）如何利用其独特的毒力因子——肽酰基精氨酸脱亚胺酶（PPAD）修饰辅助菌毛亚基（FimC, FimD, FimE），从而调控Toll样受体2（TLR2）相关信号通路，操纵人单核细胞来源巨噬细胞（MDM）的炎症反应，并增强细菌在巨噬细胞内的生存能力。该工作揭示了细菌蛋白瓜氨酸化在宿主免疫逃逸中的关键作用，为理解牙周炎的发病机制提供了新视角。
引言
牙周炎是一种由菌群失调引起的慢性炎症性疾病，可导致牙齿支持组织的破坏。牙龈卟啉单胞菌被认为是其中的关键致病菌之一。该菌拥有多种毒力因子，其中肽酰基精氨酸脱亚胺酶（PPAD）是原核生物界中一种独特的毒力因子，它能够将细菌和宿主来源的蛋白及多肽C末端的精氨酸残基转化为瓜氨酸。Toll样受体-2（TLR2）是宿主细胞识别牙龈卟啉单胞菌的关键受体，而菌毛是其重要的TLR2配体。菌毛轴由FimA聚合物构成，并与辅助菌毛亚基（FimC, FimD, FimE）相关。先前研究表明，PPAD对菌毛亚基的修饰可增强TLR2的激活，但该修饰对免疫细胞（特别是巨噬细胞）反应的影响尚不明确。巨噬细胞是清除细菌、协调炎症反应的核心免疫细胞，在牙周炎发展过程中，牙龈卟啉单胞菌能够影响巨噬细胞的极化与功能。
方法
本研究使用牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277野生型菌株及其同基因突变株，包括PPAD缺失突变株（ΔPPAD）、催化失活的PPAD突变株（C351A PPAD）、主要菌毛亚基FimA缺失突变株（ΔFimA）以及辅助菌毛亚基FimC（ΔFimC）和FimE（ΔFimE）缺失突变株。此外，还使用了天然缺乏主要菌毛的W83野生型菌株作为对照。从这些菌株中纯化了菌毛。人单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）被用于各种感染和刺激实验。
通过定量PCR（qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）评估了细胞因子（IL-6, IL-8）和前列腺素E2（PGE2）合成通路相关基因（COX2）的表达与分泌。利用流式细胞术和荧光显微镜分析了细菌的粘附、内吞和胞内生存情况。通过蛋白质印迹法检测了Akt的磷酸化水平。此外，对感染后的MDM进行了RNA测序（RNA-seq）分析，以全面了解转录组变化。
结果
- 1.
PPAD修饰的菌毛通过辅助亚基激活巨噬细胞促炎反应
用纯化的菌毛刺激MDM发现，来自野生型菌株的菌毛能显著诱导COX2、IL6和IL8的基因表达以及IL-6和IL-8的蛋白分泌。然而，来自ΔPPAD突变株或辅助菌毛亚基缺失突变株（ΔFimC, ΔFimE）的菌毛，其诱导促炎反应的能力显著降低。这提示，PPAD修饰的辅助菌毛亚基是激活巨噬细胞促炎反应的关键。
- 2.
菌毛制剂中残留的LPS影响可忽略
通过去除菌毛制剂中的内毒素（LPS）或使用TLR4中和抗体阻断TLR4，发现这些处理均未改变菌毛诱导的IL-6和IL-8分泌水平。这表明，菌毛诱导的巨噬细胞反应主要由菌毛蛋白本身（可能通过TLR2）介导，而非制剂中可能污染的LPS。
- 3.
PPAD与菌毛影响细菌的粘附与内吞
流式细胞术分析显示，与野生型相比，ΔFimA突变株与MDM的粘附和/或内吞水平显著降低。相反，ΔPPAD和C351A PPAD突变株表现出更高的细胞表面粘附率，但其被巨噬细胞吞噬的效率与野生型相似。荧光显微镜观察进一步证实，PPAD突变株大量聚集在细胞表面和细胞外环境中，而未能被有效内吞。辅助菌毛亚基缺失突变株（ΔFimE, ΔFimC）的内吞水平与野生型相似，表明仅FimA轴就足以介导有效的细菌摄取，但辅助亚基对于细菌在细胞内的长期生存至关重要。
- 4.
PPAD与辅助菌毛亚基调控Akt磷酸化
感染野生型菌株的MDM，其Akt磷酸化水平在感染后30分钟显著高于感染ΔPPAD突变株的细胞。同样，感染FimA、FimC或FimE缺失突变株的MDM，其Akt磷酸化水平也低于野生型感染组。然而，纯化的菌毛本身并不能诱导Akt的显著磷酸化，提示细菌的完整结构或其他因子可能参与了对PI3K/Akt通路的激活。使用Akt抑制剂预处理MDM后发现，野生型菌株诱导的IL-6分泌被显著抑制，但IL-8的分泌不受影响，表明IL-6和IL-8的分泌受不同信号通路调控。
- 5.
转录组学分析揭示复杂的免疫调控网络
RNA-seq分析表明，与感染各种突变株相比，感染野生型菌株的MDM其转录谱发生了显著改变。主成分分析显示，突变株和W83菌株的感染组位于野生型和未感染对照组之间。通路富集分析发现，在野生型感染组中，与促炎介质、白细胞介素信号、细胞因子-受体相互作用以及干扰素信号相关的通路显著上调。相反，与溶酶体和氧化磷酸化信号相关的通路则下调，这支持了PPAD修饰的辅助菌毛亚基可能影响吞噬体成熟的观点。差异表达基因包括与干扰素信号和病毒感染相关的基因、促炎细胞因子基因、参与T细胞相互作用的细胞因子基因，以及Nod、VEGF和Wnt信号通路相关基因。这些发现强调了辅助菌毛亚基在牙龈卟啉单胞菌操纵宿主免疫反应中的核心作用，并提示了与PPAD之间可能的交互作用。
讨论
本研究揭示了一种牙龈卟啉单胞菌劫持宿主防御的潜在机制。PPAD对辅助菌毛亚基的修饰（即瓜氨酸化）对于激活巨噬细胞的促炎反应至关重要。同时，这种修饰通过影响TLR2等相关信号，帮助细菌在巨噬细胞的杀菌环境中生存。
研究发现，PPAD突变株虽能强力粘附于巨噬细胞表面，却难以被有效内吞，这可能是因为PPAD活性对于诱导TLR2与整合素CR3之间的“由内向外”信号传导至关重要，而这种信号传导介导了细菌的“安全”内吞。此外，野生型感染诱导的Akt磷酸化增强，而该通路参与调控吞噬体成熟和炎症反应。然而，TLR2阻断或Akt抑制实验未能完全重现表型，提示可能存在更复杂的受体串扰和替代信号通路（如Wnt信号）参与其中。
转录组数据进一步揭示了感染的复杂性，野生型菌株强烈上调了与抗病毒反应相关的基因。这或许反映了宿主对病原体的一种广泛防御状态，也可能与牙龈卟啉单胞菌感染和某些病毒性疾病之间的流行病学关联有关。同时，与T细胞相互作用相关的细胞因子基因表达改变，提示该菌可能通过影响巨噬细胞功能来间接抑制T细胞免疫。
虽然直接在辅助菌毛亚基上检测到瓜氨酸化存在技术挑战，但本研究的遗传学和功能学证据强烈支持PPAD通过修饰这些亚基来发挥关键作用。这种修饰可能增强了它们作为TLR2配体的活性。
结论
本研究系统评估了PPAD对巨噬细胞炎症反应和抗菌功能的影响，结果强调了PPAD驱动的菌毛修饰在TLR2相关免疫反应和牙龈卟啉单胞菌毒力中的重要性。辅助菌毛亚基的PPAD依赖性瓜氨酸化，是牙龈卟啉单胞菌协调促炎反应与胞内生存这一双重策略的核心环节，为深入理解牙周炎的免疫病理机制和寻找新的治疗靶点提供了重要依据。
