《Cells》：A Novel In Vitro Vascularized Dermis Organotypic Model of Acute and Chronic-Like Wounds
Shirin Saberianpour,
Nadia Terrazzini and
Matteo Santin
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本文介绍了一种创新的体外器官样真皮伤口模型。该模型利用合成仿生底物PhenoDrive-Y，在常规2D细胞培养平面上驱动人成纤维细胞和血管内皮细胞形成血管化组织样结构，并通过模拟急性和慢性伤口早期阶段（如添加U937单核细胞和/或促炎细胞因子IL-6/TNF-α）来研究伤口愈合机制。此模型克服了传统2D划痕实验和快速降解的3D凝胶模型的局限，为在体外研究急/慢性创面病理生理机制，以及评估伤口敷料（如N-A Ultra、Kaltostat）的生物相容性提供了一种更稳健、可重复、生理相关性的工具平台。
1. 引言
伤口愈合是一个由一系列生化事件精确调控的复杂级联过程，涉及凝血、炎症、增殖和组织重塑四个重叠阶段。急性伤口（如创伤或手术所致）通常会按此进程规律、及时地愈合。相反，慢性伤口（如糖尿病足溃疡、静脉性腿部溃疡、压力性溃疡）则长期滞留在未解决的、失调的慢性炎症状态，其特征包括持续性炎症、成纤维细胞功能受损、血管生成缺陷以及细胞外基质(ECM)沉积紊乱。慢性伤口对全球公共卫生构成重大挑战，其治疗也给医疗系统带来了沉重的经济负担。
慢性伤口的微环境在生化和细胞层面与急性伤口不同。其根本特征之一是基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂之间的持续失衡，导致对关键生长因子、受体和新沉积的ECM不受控地降解。此外，成纤维细胞衰老、促炎细胞因子（如白细胞介素-6 (IL-6) 和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)）持续存在，阻碍了伤口向增殖期的过渡。
鉴于慢性伤口复杂的病理生理学，当前迫切需要开发能够准确反映其复杂微环境的标准化体外模型。现有模型，如基于单层细胞的过度简化的划痕实验，或使用批次差异大、降解快速的天然水凝胶（如Matrigel）的复杂3D凝胶封装系统，都存在局限性。这些模型难以捕捉慢性伤口特征，或无法有效将其与急性状况关联，限制了基础研究的进展和新治疗方法的临床转化。因此，创建一个稳健、明确、架构合适且能长期模拟动态愈合阶段的伤口模型是主要挑战。
2. 材料与方法
本研究旨在通过基于成纤维细胞和内皮细胞共培养的真皮器官样模型，来模拟急性和慢性伤口的早期阶段。
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2.1. 制备真皮样器官样模型：将合成仿生底物PhenoDrive-Y (PD-Y)涂布在组织培养板(TCP)上。将人成纤维细胞(MRC-5)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以1:1的比例（各10万个细胞）在涂有PD-Y或未涂布的TCP上共培养48小时，以形成组织样结构（PD-Y）或单层细胞（未涂布TCP）。
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2.2. 诱导急性和慢性伤口样条件：使用移液器吸头在共培养物中心区域制造划痕损伤。为模拟伤口引发的急性炎症状态，向每个孔中添加10万个U937单核细胞。为模拟慢性伤口早期阶段，在添加U937细胞的同时，在培养基中添加含有IL-6 (100 ng/mL) 和 TNF-α (135 ng/mL) 的细胞因子混合物。设立仅机械划痕、无炎症条件的对照组。所有样品在37°C、5% CO2条件下继续孵育24小时。
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2.3. 评估关键愈合参数：在伤口诱导24小时后，通过四个主要参数量化对照组、急性和慢性模型之间的功能差异。
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2.3.1. 细胞迁移：通过光学显微镜在划痕后立即和24小时拍摄划痕区域图像，使用ImageJ软件测量细胞前沿之间的距离，以评估划痕闭合情况。
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2.3.2. 血管生成：通过光学显微镜定性评估HUVEC形成的管状网络。通过CD31免疫荧光染色，并结合DAPI复染，使用共聚焦显微镜的Z-堆栈成像来定量评估形成的血管化结构的体积。
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2.3.3. 细胞外基质成分沉积：通过组织化学染色（阿尔新蓝染色(Alcian Blue)检测糖胺聚糖(GAGs)，天狼星红染色(Picrosirius Red)检测胶原蛋白）对划痕区域及边缘的ECM合成与沉积进行定性评估。同时，通过分光光度法定量测定细胞培养上清液中可溶性胶原蛋白和GAGs的浓度。
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2.3.4. 炎症细胞分化：通过免疫荧光染色分析U937单核细胞在不同伤口模拟条件下的分化。使用诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体标记M1型促炎巨噬细胞，使用CD206抗体标记M2型抗炎巨噬细胞。
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2.4. 伤口敷料生物相容性研究的模型验证：通过在模拟急性或慢性伤口条件下的共培养物中，应用两种临床可用的伤口敷料（基于纤维素的N-A Ultra和基于海藻酸盐的Kaltostat水凝胶）来验证模型。评估敷料对划痕闭合、组织样结构形成、ECM沉积以及巨噬细胞极化的影响。
3. 结果
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3.1. PD-Y诱导的真皮器官样成纤维细胞/HUVEC共培养物的形态学分析：PD-Y能够诱导细胞形成血管化组织样结构，而非简单的单层细胞。模拟慢性伤口的模型显示出受挫的血管生成和成纤维细胞重组，其划痕区域闭合不完全，且闭合速度显著慢于模拟急性伤口的模型。
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3.2. 器官样伤口模型在伤口敷料生物相容性研究中的应用：N-A Ultra敷料在急性伤口模拟条件下，促进了划痕区域的完全闭合，并促进了新的、沿划痕主轴排列的组织样结构形成，同时恢复了细胞在胞外沉积胶原蛋白和GAGs的能力。但在慢性伤口模拟条件下，N-A仅带来微弱的改善。Kaltostat敷料在急性和慢性条件下均促进了更快的伤口间隙闭合，并在急性条件下增强了胶原蛋白和GAGs的沉积。
4. 讨论
本研究首次成功建立了一种使用仿生底物PhenoDrive-Y的体外器官样共培养模型，能够模拟急性和慢性伤口状态的早期阶段。该模型重现了慢性伤口的许多病理特征，包括成纤维细胞迁移受损、血管生成受损、ECM成分沉积紊乱以及炎症细胞表型变化。应用临床可用伤口敷料后，这些过程的改变得到部分逆转。
PhenoDrive-Y支持在2D平面上形成有组织的组织样结构，且无需凝胶封装，其结构稳定性可维持超过72小时，优于许多快速降解的天然水凝胶。慢性伤口模型显示出显著降低的成纤维细胞迁移和划痕间隙闭合能力，这与临床病理学一致。血管生成缺陷表现为管状结构更细、常不连续。ECM沉积模式显示，慢性伤口模型中胶原纤维薄且碎片化，糖胺聚糖分布失调，而上清液中胶原和GAGs水平显著更高，反映了人类非愈合性溃疡的病理特征。有趣的是，在划痕诱导和单核细胞接种24小时后，急性和慢性伤口模型的巨噬细胞极化（M1/M2）未显示显著差异，这可能与诱导时间较短有关。
N-A Ultra敷料在急性伤口模型中显示出良好的愈合潜力，但在慢性伤口模型中改善有限。相比之下，海藻酸盐基的Kaltostat敷料在所有测试参数上（血管生成、成纤维细胞组织和ECM沉积）都显示出更明显的刺激作用。本模型整合了成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞，无需封装于凝胶或支架中，克服了现有模型的许多局限，为机制研究、生物材料评估和伤口疗法临床前筛选提供了一个稳健、可重复、操作友好的平台。
5. 结论
本研究描述了一种器官样体外伤口模型，能够清晰区分急性与慢性伤口状态的早期阶段。该系统重现了慢性伤口的重要病理特征，同时保持了超越传统培养平台的架构完整性。该模型对治疗干预的响应进一步支持了其转化价值。总体而言，该模型克服了现有伤口愈合系统的主要局限，为机制研究、生物材料评估和潜在伤口疗法的临床前筛选提供了一个强大、可重复且易于操作的平台。
