解码口腔益生菌S. dentisani 7746的庞大武器库：14种细菌素的基因组组织、调控表达及其在群体感应系统中的作用
《Journal of Oral Microbiology》：Streptococcus dentisani7746 encodes a cocktail of 14 bacteriocins associated with Com and Blp-like quorum sensing regulatory systems
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本推荐介绍一项关于口腔益生菌——齿链球菌dentisani亚种7746（S. dentisani 7746）的突破性研究。该研究通过基因组挖掘和转录分析，首次全面解析了该菌株编码的14种细菌素（Bacteriocin）的全貌，并揭示了其受完整的类Com（能力）和类Blp（细菌素样肽）群体感应（Quorum Sensing）系统调控的模型。研究不仅命名了8种新型“Denticins”细菌素，还证实了S. dentisani 7746是目前已知拥有最多细菌素编码基因的细菌分离株，其部分基因簇可能源自肺炎链球菌的水平基因转移，为开发基于多靶点细菌素“鸡尾酒”疗法防治口腔疾病提供了新的理论基础和候选分子。
引言：口腔益生菌的抗菌武器
由人类共生细菌和益生菌菌株产生的抗菌物质，在农业、食品工业、人类医学和口腔保健领域的应用正重新获得关注。其中，细菌素——一种由细菌核糖体合成的抗菌肽（AMP），因其引发细菌耐药性的速率较低而备受关注。它们可能经过翻译后修饰或保持未修饰状态，并分泌到细胞外环境中，可表现出广谱或窄谱活性，且生产者菌株通常编码免疫蛋白以保护自身免受其作用。基因组挖掘已成为发现细菌产生的抗菌肽的基石，BAGEL4或antiSMASH等工具的使用已证明了编码细菌素的基因簇广泛存在。
在此背景下，口腔益生菌齿链球菌口腔亚种dentisani菌株7746（以下简称S. dentisani7746）脱颖而出。先前有研究报道，在S. dentisani7746基因组的一个细菌素编码区域中，存在至少11种细菌素肽。该物种在全球个体的口腔微生物群中均有发现，据报道，在无龋儿童牙菌斑中的相对丰度显著高于患龋儿童。S. dentisani7746在抑制多种口腔病原体（包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌）生长方面表现出显著功效，这种抗菌活性归因于其基因组中编码的大量抗菌肽。然而，在实验室条件下评估全套肽类抗菌分子表达情况的实验尚未进行。
S. dentisani7746细菌素编码区域最有趣的特征之一是其与群体感应和能力相关基因相关联。类似细菌素生产和遗传能力诱导等依赖于群体感应的细胞功能，由肽调节的双组分系统（TCS）协调。在肺炎链球菌中，能力调控依赖于ComC（信息素）-ComDE（肽调节TCS）系统，而细菌素生产则由BlpAB-BlpC-BlpHR系统以类似方式调控。然而，先前关于S. dentisani7746细菌素区域调控系统的命名存在分歧，暗示该菌株中可能存在多个与细菌素编码区域相关的群体感应系统。
材料与方法：基因组挖掘与表达验证
本研究旨在对S. dentisani7746完整基因组中的细菌素生物合成基因簇（BGC）进行深入的in silico表征，并通过RT-PCR分析评估细菌素基因的表达。
研究人员利用在线工具BAGEL4和antiSMASH 6.0，对S. dentisani7746的基因组进行了细菌素编码基因的筛查。随后，使用NCBI Blast和KEGG等在线工具，对鉴定出的推定前体肽、TCS、推定免疫蛋白和翻译后修饰酶的基因组序列进行手动管理和注释。通过MicrobesOnline进行基因组背景的比较研究。利用Clone Manager程序搜索二重对称性来鉴定可能作为终止子的推定茎环结构。通过SMART和InterPro进行蛋白质序列-结构分析及结构域预测。
对于基因表达研究，S. dentisani7746在BHI肉汤中好氧培养。在生长对数中期和稳定期收集样品，用于总核酸提取。通过RT-PCR检测多顺反子转录本。首先使用Turbo DNA-free?试剂盒去除基因组DNA，然后使用High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成第一链cDNA。使用跨基因引物进行PCR，以扩增基因组DNA（阳性对照）、纯化的RNA（阴性对照）和cDNA（测试样本）。通过琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物。跨基因引物借助NCBI Primer BLAST设计，确保结合在上游基因的3‘端和下游基因的5’端，从而扩增完整的基因间区域长度。
结果：发现两个细菌素基因簇
1. 基因组中的两个细菌素基因簇
对S. dentisani7746完整基因组的检查发现了一个值得注意的含有抗菌肽的区域（类blp基因座），位于基因组的第四象限。该区域与先前报道的细菌素基因盒一致。随后的antiSMASH分析验证了这一发现，并鉴定出一个先前未记录的第二个潜在区域（类com基因座），位于基因组的第一象限，与细菌素生产相关。这两个基因座接受了深入研究。
细菌素生物合成基因座通常包含负责加工和输出新合成肽以及促进生产者生物体自身免疫的ABC转运蛋白。在S. dentisani7746基因组中，发现了编码两个转运蛋白的基因：位于第一象限的基因座SDENT7746_00485和位于第四象限的基因座SDENT7746_08315。对这两个基因座编码蛋白质的结构预测表明，存在一个N末端肽酶C39结构域、一个通透酶结构域和一个C末端ATP酶结构域。这种结构域架构与先前表征过的、参与抗菌肽或肽信息素加工和输出的SunT型转运蛋白一致。通常在SunT型转运蛋白附近，会发现编码具有一个预测跨膜螺旋和功能未知的生物素-脂酰结构域的转运辅助蛋白的基因。相应地，在两个转运蛋白编码基因附近，发现了两个体现这种结构域架构的蛋白质编码基因。
SunT型转运蛋白通常受涉及肽群体感应组氨酸激酶（HK）和LytTR家族反应调节蛋白（RR）的双组分系统（TCS）调控。基因组背景分析和随后的蛋白质产物结构预测揭示，在第四象限的SunT型转运蛋白附近，存在一个先前未描述的具有这些特征的TCS。该HK的基于结构域的序列分析预测其具有一个带有7个跨膜螺旋的N末端结构域，以及一个与金黄色葡萄球菌AgrC和肺炎链球菌ComD相似的C末端组氨酸激酶样ATP酶结构域，两者均涉及群体感应。在TCS和ABC转运蛋白基因之间，还定位了一个编码群体感应系统信息素的基因座。这种基因组排列可能标志着TCS、诱导肽和转运蛋白基因之间的调控联系，类似于先前在肺炎链球菌菌株中描述的细菌素免疫区域（BIR）。与肺炎链球菌中发现的调控蛋白BlpS、BlpR、BlpH和BlpC的等位基因变体进行的氨基酸序列比较，证实了这些调控蛋白在S. dentisani7746中的高度保守性。因此，研究人员将相关基因重新命名为blpA/B/C和blpH/R/S。
第二个与细菌素生产相关的关注区域位于第一象限的转运蛋白和转运辅助蛋白基因上游，两侧是acpP和purC基因。这种基因组排列与在缓症链球菌和肺炎链球菌中发现的cib和bib基因座惊人地相似。鉴于S. dentisani7746中基因产物在基因组组织和功能预测上的相似性，研究人员将SDENT7746_00485/00490重新命名为comA/B。
2. 类Blp细菌素基因盒
位于第四象限的细菌素基因盒包含四个调控基因：blpS、blpR、blpH和blpC。TCS基因blpR和blpH，以及一个额外的DNA结合结构域基因blpS，位于编码SunT样转运蛋白blpA和辅助蛋白blpB的基因附近。此外，编码信息素前体肽BlpC的blpC基因位于TCS和转运基因之间。这种基因组组织与肺炎链球菌物种中编码细菌素样肽的BIR非常相似。
S. dentisani7746的BIR区域在起始和末端保留了肺炎链球菌菌株中常见的blp基因盒基因，特别是blpT和pncP。氨基酸序列比对证实了编码假设蛋白BlpT的基因与调控、加工和转运蛋白共存。在S. dentisani7746基因盒的另一端，定位了一个编码推定的II型CAAX异戊二烯基内肽酶PncP的保守性较低的基因。II型CAAX异戊二烯基内肽酶在细菌素自身免疫中发挥作用。
在blpA和pncP之间共鉴定出23个额外的基因/ORF。通过蛋白质结构/结构域预测研究和氨基酸序列比对，研究人员鉴定出第二个II型CAAX异戊二烯基内肽酶（相应命名为BlpY）以及编码假设蛋白BlpV的基因。基因SDENT7746_08230编码一个保守的硫氧还蛋白结构域蛋白，根据蛋白质结构域保守性和基因组背景，该基因被命名为tdpA。在剩余的20个基因中，9个编码推定的免疫蛋白，11个编码推定的类blp细菌素结构前体肽。这些基因以假定的转录单元形式组织，通常是一个或两个细菌素前体肽后跟一个或两个免疫蛋白。
推定的免疫蛋白可根据其预测的二级结构分为三组：三个具有四个推定跨膜螺旋的蛋白质，五个具有两个推定跨膜螺旋的蛋白质，以及一个含有类肠菌素A免疫蛋白结构域的蛋白质。氨基酸序列比较显示，其中七个蛋白质是先前在肺炎链球菌blp基因盒中描述的推定膜相关免疫蛋白的等位基因变体。因此，这些基因被相应命名。S. dentisani7746的BIR区域包含两个blpL拷贝，编码两个具有90%同一性的蛋白质。
3. 类Blp区域内的调控元件
对S. dentisani7746的BIR区域中推定操纵子上游序列进行了潜在启动子序列分析。参考肺炎链球菌菌株BIR区域中保守的BlpR结合位点和延伸的-10序列，鉴定出十个推定的类blp启动子序列。在所有十个类blp启动子序列中，均鉴定出两个（或保守性较低的变体）由12个碱基对间隔的九碱基对序列AATTCAAGA的直接重复，这可能作为推定的BlpR结合位点。在六个细菌素操纵子的启动子区域上游鉴定出一个保守的延伸-10区域，但在PblpS、PtdpA、PblpA和PblpT启动子中未发现。在该区域鉴定出几个自由能范围为-9.3至-25.9 kcal/mol的茎环，可能作为推定的终止子。
4. 类Com系统
位于基因组第一象限的类comAB细菌素基因盒包含十个ORF。comA和comB基因伴随着八个额外的ORF：四个推定的细菌素immunity proteins（命名为impB、impC、impD、impE），三个结构前体肽，以及一个编码假设蛋白的ORF。在acpP、impD、impE下游以及comB下游鉴定出自由能范围为-11.5至-9.2 Kcal/mol的四个茎环，可能作为转录终止子。
四个推定的细菌素免疫蛋白均呈现具有两个跨膜螺旋的预测二级结构。编码假设蛋白的基因SDENT7746_00460编码一个32个氨基酸的蛋白质，在缓症链球菌BCC33和婴儿链球菌UC6950A中保守。
通常，编码ComAB加工和输出系统的comAB基因在链球菌的能力状态下由反应调节蛋白ComE诱导。在S. dentisani7746基因组的第四象限，通过手动检查发现了另一个AgrC-ComD样群体感应HK、一个带有LytTR DNA结合结构域的RR，以及一个编码ComC信息素前体的comC基因。这个调控簇位于精氨酸和谷氨酸的转移RNA编码基因之间，与其他链球菌菌株中comCDE操纵子的排列一致。因此，研究人员将这些基因命名为comC/D/E。
通过手动搜索comX和comW早期能力基因，并参考其他链球菌基因组中其基因组背景的保守性信息，在S. dentisani7746中鉴定出两个comX旁系同源物，分别命名为comX1和comX2。此外，还鉴定出一个同源的comW基因，命名为comW。
5. 细菌素同源性分析
S. dentisani7746的所有细菌素均表现出N末端双甘氨酸型前导肽。前体肽全长（特别是成熟部分）的保守性被用于鉴定其他物种中的同源物。
位于S. dentisani7746类blp区域的11个细菌素中，有6个与前体肽保守性在87%-97%（氨基酸同一性）、核心肽保守性在84%-98%的肺炎链球菌Blp细菌素表现出高度保守性。这些基因根据序列相似性被命名。另外三个基因座与缓症链球菌中的未命名同源物具有高度相似性，在缺乏基因名称的情况下，研究人员将这些基因座命名为dntA、dntD、dntE，分别编码齿链霉素A、D、E。基因座SDENT7746_08265编码的预测细菌素产物与变形链球菌的Mutacin IV有44%保守性。基因座SDENT7746_08250的产物与乳房链球菌的Ubericin A在前体肽和核心肽上分别有54%和65%的保守性。研究人员将这些基因座命名为dntB和dntC，分别编码齿链霉素B和C。
位于S. dentisani7746类com区域的细菌素与口腔链球菌和缓症链球菌物种中的未命名细菌素高度保守。研究人员将这些基因座命名为dntF、dntG、dntH，分别编码推定的齿链霉素F、G、H前体肽。
6. 细菌素和自诱导分子的成对比较
对包括两个推定的自诱导分子（ComC和BlpC）在内的所有细菌素进行一级序列比对和成对相似性比较。除齿链霉素C外，所有13种细菌素和两种自诱导分子均表现出保守的双甘氨酸切割位点。全长前体肽序列的成对比较显示出较低程度的保守性。当分别比较仅前导肽或仅核心肽时，前者明显比后者更为保守。根据序列保守性，前导肽明显分为两个不同的组。特别是包含DntA、DntE、DntB、BlpD、BlpM和BlpQ的组内，前导肽序列高度保守。核心肽的高度变异性与前导肽序列的最高保守性一致，这与后者被加工酶和输出系统识别的作用相符。值得注意的是，编码在Blp区域和Com区域的细菌素表现出两个明显的区别性特征，与其不同的生物学背景一致。Blp区域细菌素更长（44-61个氨基酸）并含有偶数个半胱氨酸残基，兼容于形成二硫键。相反，来自Com区域的细菌素（即DntF、DntG和DntH）和自诱导分子（ComC和BlpC）要短得多（17-29个氨基酸），并且不含任何半胱氨酸残基，这很容易将它们与Blp衍生的肽区分开来。
有趣的是，对推定类blp细菌素操纵子启动子的比对揭示了一个可能影响齿链霉素D表达的点突变。该突变涉及谷氨酸的GAA密码子被替换为TAA终止密码子。因此，预计该突变将导致齿链霉素D前体肽序列的提前终止。根据启动子序列预期的ATG起始密码子进行预测表明，齿链霉素D缺少了原本保守的前导肽的前11个氨基酸。
7. 细菌素类别预测
使用InterPro进行细菌素类别预测。BlpM、BlpN、BlpD、BlpE、齿链霉素A、齿链霉素D和齿链霉素E被预测为类乳杆菌素相关的IIb类（双肽）细菌素。齿链霉素B含有保守的“片球菌素框”基序YGNGL，以及核心肽N末端区域的两个半胱氨酸残基。因此，它被预测为类片球菌素的IIa类细菌素。齿链霉素B位于类blp区域中唯一预测编码类肠菌素A免疫蛋白的基因附近。这种基因邻近性暗示了细菌素/免疫蛋白之间的功能关系。在类blp区域中，没有为S. dentisani7746的肽序列PncT、BlpQ和齿链霉素C预测到细菌素类别。由于齿链霉素C与Mutacin IV在前体肽上有48%的保守性，研究人员推测它也可能是一种类乳杆菌素相关的IIb类细菌素。
在类com基因簇中，齿链霉素H不能被归类到任何家族类型，而齿链霉素F和齿链霉素G属于IIb类乳杆菌素A/cerein 7B家族。该家族的特征是低复杂度的孔形成细菌素，其加工除了在双甘氨酸基序处进行蛋白水解切割外，不包括翻译后修饰。因此，齿链霉素F和齿链霉素G的核心肽中不含半胱氨酸残基。
8. 细菌素转录表达分析
基于in silico观察结果，研究人员接下来旨在in vivo证实鉴定的14种细菌素的表达。为此，他们使用跨基因引物进行了RT-PCR，这些引物设计用于扩增类blp和类com区域内的推定转录单元，样本来自S. dentisani7746的对数生长中期、后期和稳定期培养物。
在类blp区域内，根据鉴定出的六个启动子序列预测的转录单元设计了跨基因引物。通过这种方式，六次RT-PCR反应足以扩增该区域的所有细菌素编码基因。所有RT-PCR反应均产生了预期大小的扩增产物，这证实了类blp区域中11种细菌素的转录。值得注意的是，尽管在blpQ和pncT之间存在较长的基因间区，并且预测了一个自由能为-11.1 Kcal/mol的转录终止子，但两个基因是共转录的，这表明如果存在该终止子，它被覆盖了。
对于cib基因，研究人员使用跨
