揭示临床抗体结合IL-33的结构差异：两种不同表位决定疗效分化的分子基础

《mAbs》：Structures of clinical antibodies bound to IL-33 uncover two distinct epitopes underlying differential efficacy

本研究通过解析三种靶向IL-33的临床抗体（etokimab、itepekimab、tozorakimab）与IL-33的复合物结构，首次在原子层面阐明其抑制机制差异。研究揭示IL-33上存在两个功能迥异的表位：表位1位于IL-33/ST2结合位点1，表位2位于位点2。靶向表位1的tozorakimab可完全阻断ST2的D1-D2结构域结合，而靶向表位2的etokimab与itepekimab仅部分干扰ST2的D3结构域识别，这为三者细胞实验中疗效差异提供了结构解释。本研究为现有IL-33靶向疗法的优化与下一代抑制剂设计提供了关键结构框架。

　　

IL-33抗体与ST2受体结合表位的结构解析

白细胞介素-33（IL-33）是IL-1细胞因子家族的一员，作为一种警报素，在细胞损伤或感染时释放，并通过与受体ST2和IL-1RAcP结合驱动2型炎症反应，是哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等炎症性疾病的关键治疗靶点。目前，靶向IL-33或其受体ST2的单克隆抗体是主要的治疗策略，但抗体中和IL-33的结构机制尚不明确。

三种临床抗体的中和效能分析

本研究聚焦于三种处于临床试验阶段的抗体：etokimab (ANB020)、itepekimab (REGN3500) 和 tozorakimab (MEDI3506)。序列分析显示，尽管三者框架区保守，但互补决定区（CDR）存在显著差异，暗示其中和机制可能不同。

表面等离子共振（SPR）结合实验证实，三者均以低纳摩尔亲和力与IL-33结合，其亲和力达到或超过IL-33与ST2的结合力。在HEK-Blue IL-33报告细胞实验中，三者在低浓度IL-33刺激下表现出相似的半数抑制浓度（IC₅₀），但在更高抑制水平（IC₉₀）上，tozorakimab显示出显著更强的抑制能力。在低IL-33浓度下，tozorakimab的IC₉₀分别比etokimab和itepekimab强3.4倍和15.9倍；在高浓度下，仍分别强2.3倍和6.0倍。在原代人外周血单个核细胞（PBMC）实验中，tozorakimab的抑制效力也显著优于另外两者，其IC₅₀分别比etokimab和itepekimab低13.5倍和15.3倍。这些结果表明三种抗体在功能上存在效能差异。

抗体-IL-33复合物的结构测定

为探究分子机制，研究团队利用X射线晶体学和冷冻电镜（cryo-EM）技术，解析了三种抗体与IL-33的复合物结构。首先获得了tozorakimab Fab与IL-33的晶体结构。竞争实验表明，tozorakimab与etokimab、itepekimab的表位不重叠，而后两者表位重叠，因此研究巧妙地利用tozorakimab作为“辅助Fab”，成功解析了IL-33/tozorakimab/etokimab和IL-33/tozorakimab/itepekimab两种三元复合物的冷冻电镜结构。

结构分析显示，成熟的IL-33 C端结构域（112-270位氨基酸）呈现经典的β-三叶草折叠。etokimab和itepekimab结合在IL-33的β4-β5和β8链附近，而tozorakimab则结合在远端，位于β2-β3和β6链区域。

两个不同的中和表位

已知IL-33与ST2的结合界面包含两个空间上独立的位点：位点1涉及IL-33与ST2的前两个免疫球蛋白样结构域（D1和D2）的广泛亲水相互作用；位点2主要由IL-33与ST2末端结构域（D3）的疏水接触形成。

将抗体复合物结构与IL-33/ST2复合物结构进行比对后发现，三种抗体均会与ST2发生空间冲突，但位置不同：

1. 1.
   表位2（位点2）：etokimab和itepekimab靶向于此。它们的结合表位与ST2的D3结构域结合区域（位点2）重叠，因此会与ST2的D3域发生空间冲突，部分干扰其结合。
2. 2.
   表位1（位点1）：tozorakimab独家靶向于此。其结合表位与ST2的D1-D2结构域结合界面（位点1）直接重叠，从而在空间上完全阻断了ST2的D1-D2域与IL-33的结合。

表位2的分子相互作用细节

etokimab和itepekimab虽然序列不同，但结合表位高度重叠，共享11个IL-33残基。两者均利用保守的酪氨酸残基（重链Y101和轻链Y49）与IL-33的关键残基（E165和K180）形成相互作用，这是它们识别相似表位的基础。etokimab与IL-33的界面埋藏面积为939 ?²，而itepekimab为909 ?²。其中，itepekimab的表位与ST2 D3域的重叠面积更大（386 ?²，共享11个残基），表明其更接近ST2的结合模式。

表位1的分子相互作用与功能验证

tozorakimab与IL-33的界面埋藏面积更大，达到1149 ?²，涉及24个IL-33残基。其重链CDR3在识别中起核心作用，与IL-33的E139等残基形成密集的氢键和盐桥网络。静电势分析显示，IL-33表位1区域带负电（以E139为中心），而tozorakimab的互补表面带正电（以K100为中心），这种电荷互补增强了结合。

通过定点突变实验进一步验证了功能：tozorakimab重链的突变会完全破坏其与IL-33的结合和中和活性；而轻链的突变虽能保留结合能力，却显著削弱了其中和功能（IC₅₀值升高56.8至351.3倍）。这表明，tozorakimab的重链主要负责高亲和力结合，而其轻链则对实现阻断ST2结合的空间位阻效应至关重要。

竞争性SPR实验验证表位功能差异

SPR竞争实验直观地展示了不同表位抗体在阻断ST2结合效能上的差异。当etokimab或itepekimab预先饱和结合IL-33后，再注入ST2，传感器响应信号仍会显著增加，说明ST2仍能部分结合。而当tozorakimab预先结合后，再注入ST2则不会引起信号增加，表明其能完全阻断ST2与IL-33的结合。这直接证实了靶向表位1（位点1）能实现更有效的受体结合竞争。

讨论与展望

本研究首次完成了对IL-33的全面表位作图，揭示了抗体中和IL-33的两种根本不同的分子机制。靶向表位1（位点1）的抗体（如tozorakimab）通过直接、完全地空间占据ST2的关键结合界面（D1-D2域）来实现高效抑制。而靶向表位2（位点2）的抗体（如etokimab和itepekimab）仅部分干扰ST2的D3域结合，允许残余的受体结合，这可能是其临床单药疗效受限的结构基础。

位点1是IL-33与ST2结合的主要热点，具有广泛的相互作用面和显著的静电互补特征，使其成为更有效的抗体靶向位点。研究指出，未来抗体优化可侧重于：1. 工程化轻链以增强空间位阻效应；2. 开发直接靶向ST2结合界面的高亲和力单域抗体。此外，鉴于IL-33相关疾病的炎症复杂性，联合疗法（如同时靶向IL-33/ST2和IL-4/IL-13通路）或双特异性抗体策略可能比单药治疗更具前景。

综上所述，这项研究不仅为理解现有IL-33靶向抗体疗效差异提供了关键的分子解释，也为基于结构的理性设计下一代高效IL-33/ST2通路抑制剂奠定了坚实的框架。