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本研究系统探讨了表达载体配置对一种结构复杂的、具有突触门控功能的三特异性T细胞衔接子（TriMab）在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中稳定表达的关键影响。通过对比三种不同载体策略，研究发现通过重链基因顺序反转和轻链基因分载体表达（Vector Approach 3, VA3）的优化方案，显著提高了转染恢复速度、产品滴度（>2 g/L），并有效减少了错误配对产物（如半抗体、knob:knob二聚体）的形成，从而为高产量、高质量下一代三特异性抗体的工业化生产提供了实用的载体设计框架。
绪论：三特异性抗体的挑战与机遇
近年来，多特异性抗体已成为生物治疗领域的前沿，其中三特异性抗体（trispecific antibodies, trisAbs）因其能同时靶向多个表位而展现出巨大的治疗潜力。然而，这类复杂分子通常由多条不对称的重链（heavy chains, HCs）和轻链（light chains, LCs）构成，在生产细胞系中需要精确配对，这给稳定细胞系开发带来了巨大挑战，常导致产品得率低、错配物种多等产品质量（product quality, PQ）问题。尽管已有如“孔洞-凸起”（knobs-into-holes, KiH）技术、工程化二硫键和静电导向突变等抗体工程技术来促进正确配对，但仍无法完全消除错配。因此，优化表达载体配置成为提高这类“难表达”（difficult-to-express, DTE）分子可制造性的关键策略之一。
TriMab抗体结构
本研究使用的分子是一种突触门控且亲和力经过调控的三特异性T细胞衔接子（TriMab）。其结构包含两条不对称的重链（HC1孔洞链和HC2凸起链），通过KiH技术促进异源二聚化。孔洞链携带“RF”（H435R/Y436F）突变以降低与蛋白A的结合。三条轻链（LC1、LC2、LC3）通过静电导向突变（在示意图中以+/-符号表示）和位点特异性二硫键与相应的重链正确配对。
载体策略1（VA1）导致TriMab稳定池表达低下
初步策略（VA1）采用从简单抗体格式推断的载体配置：一个双HC载体（带有谷氨酰胺合成酶[glutamine synthase, GS]选择标记），其中更复杂的凸起HC位于孔洞HC上游；以及一个三LC载体（带有嘌呤霉素[puromycin, Puro]选择标记），顺序为LC2、LC1、LC3。将这两种载体共转染CHO宿主细胞后，TriMab池的转染恢复时间显著延长（第22天），而单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）对照在第14天即恢复。在恢复的两个池中，凸起HC的mRNA水平高于孔洞HC，且LC1的mRNA丰度低于LC2和LC3。在分批补料培养中，这些池的生长和活力尚可，但最终滴度很低（池1为45 mg/L，池2为23 mg/L），且产品中含有高分子量物种（high molecular weight species, HMWS）、半凸起抗体（half knob）和凸起:凸起二聚体（knob:knob dimer）等错配产物。
载体策略2（VA2）：LC和HC载体的顺序表达仍产生低表达TriMab稳定池
考虑到抗体的正确折叠和处理可能需要过量的LC与HC配对，研究者设计了载体策略2（VA2），即先将三LC载体稳定转染CHO细胞，生成仅表达LC的细胞池，然后再转染双HC载体。然而，这种顺序表达策略并未改善情况。所有TriMab池的转染恢复时间仍然延长（第19天）。mRNA分析再次显示凸起HC表达高于孔洞HC，且LC1表达不足，而LC2和LC3过度表达。在分批补料中，这些池的滴度仍然很低（最高60 mg/L），且产品中同样存在HMWS、半凸起抗体和凸起:凸起二聚体。
载体策略3（VA3）：反转HC顺序并将LC分散到两个载体中显著改善池性能与产品质量
基于前两种策略中孔洞HC和LC1表达不足的观察，研究者优化出载体策略3（VA3）。该策略包含三项关键改变：1）反转双HC载体中两个基因的顺序，使孔洞HC位于凸起HC上游；2）将三条LC的编码基因拆分到两个载体上，一个双LC载体（LC3在上游，LC2在下游，带Puro标记），一个单LC载体（仅LC1，无选择标记）。使用VA3载体共转染后，细胞池的转染恢复有所改善（第18天）。mRNA分析显示，孔洞HC的表达量现在高于凸起HC，且LC1和LC3的mRNA表达丰盛。更重要的是，在分批补料培养中，VA3池的滴度（最高191 mg/L）显著高于VA1和VA2池。最突出的改进体现在产品质量上：半凸起抗体在所有三个池中均未检出，凸起:凸起二聚体也几乎消失（仅在池2中检测到0.1%）。
从三种载体策略衍生的克隆细胞株中，高比例克隆不表达TriMab
从VA1、VA2和VA3产生的稳定池中分别分离了克隆细胞株。高通量筛选显示，能检测到TriMab表达的克隆比例极低（VA1: 3/117；VA2: 1/63；VA3: 8/87）。其中，VA1和VA2来源的表达克隆滴度低于60 mg/L，而VA3来源的顶级克隆滴度显著更高（最高达1119 mg/L）。对表达与非表达克隆的基因拷贝数（gene copy number, GCN）和mRNA分析发现，所有表达克隆都含有凸起HC（VA1、VA2克隆）或同时含有凸起与孔洞HC（VA3克隆）的基因及mRNA，而非表达克隆则缺少一种或两种HC的基因与mRNA。这表明克隆不表达的主要原因是相关HC基因在克隆筛选过程中丢失，而非基因沉默。
源自载体策略3的克隆细胞株在AMBR分批补料中实现超过2 g/L的滴度
将VA3来源的6个表达全部5条TriMab链的克隆在AMBR15微型生物反应器中进行14天分批补料培养评估。克隆间生长（峰值活细胞密度[viable cell density, VCD]）、活力和代谢存在差异。最终，克隆7和克隆8获得了最高的终点滴度，分别达到2928 mg/L和2365 mg/L，超过了2 g/L的工业相关阈值。细胞特异性产率（cell-specific productivity, qP）最高的也是克隆7（23.5 pg/细胞/天）。
载体策略3产生的TriMab展现出正确的产品质量
对AMBR15培养的VA3克隆（5-9）产生的TriMab进行全面的产品质量分析。尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）显示，克隆6-9产品的HMWS低于5%。毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（capillary electrophoresis–sodium dodecyl sulfate, CE-SDS）分析显示其低分子量物种（low molecular weight species, LMWS）低于10%。完整蛋白质谱（intact LC-MS）分析表明，克隆6-9的产品中，正确配对物种占比超过95%。为进一步确认轻链正确配对，使用了免疫球蛋白降解酶（immunoglobulin-degrading enzyme, IgdE）消化后进行亚基质谱分析，该方法可鉴定25/26种潜在错配物种。分析证实克隆6-9的产品中不存在轻链错配物种。相比之下，克隆5的产品质量异常，含有高水平的HMWS（>8%）和LMWS（>90%），完整质谱分析显示其主要由半凸起抗体（~90%）和凸起:凸起二聚体（~10%）构成。
讨论与展望
本研究结果凸显了载体配置对TriMab表达的强烈影响。VA1和VA2策略中，凸起HC相对于孔洞HC的过表达，以及LC1的表达不足，导致了错误配对物种的形成，这可能引起细胞应激反应，进而影响转染恢复和池性能。而在VA3策略中，将孔洞HC置于上游可能有助于蛋白质折叠/组装，减轻细胞负担，从而允许更高的重链转录和更平衡的链表达。这种优化配置近乎完全消除了半抗体和凸起:凸起二聚体，并最终在克隆水平实现了超过2 g/L的滴度和正确的产品质量。尽管克隆筛选过程中仍存在高水平损耗（多数克隆不表达），但VA3策略显著提高了获得高表达克隆的概率。本研究为复杂三特异性抗体的基因表达载体理性设计建立了一个框架。未来，可结合启动子调节、翻译调控、位点特异性整合、转座子技术、优化宿主细胞系和改进生物工艺参数等策略，进一步优化三特异性抗体的生产率和同质性。
材料与方法摘要
研究使用了阿斯利康（AstraZeneca）专有的悬浮适应性CHO-K1衍生宿主细胞。通过限制性内切酶消化和连接方法构建了编码TriMab和对照mAb的表达质粒。使用Amaxa Nucleofector系统进行稳定转染以生成稳定池，并通过单细胞打印进行克隆筛选。在AMBR15系统、摇瓶或96深孔板中进行分批补料培养评估抗体生产。使用蛋白A（Protein A, PA）亲和层析进行产品纯化和滴度测定。产品质量通过尺寸排阻色谱、毛细管电泳-十二烷基硫酸钠、完整及亚基液质联用等技术进行分析。通过转录组测序（RNA-seq）分析mRNA表达，并通过微滴数字PCR（droplet digital PCR）进行基因拷贝数分析。
