澳大利亚Peziza echinospora物种多样性研究：确认分布并描述两个具有生态学意义的新种P. austroechinospora与P. meridionalis

《Mycologia》：Exploring the diversity of Peziza echinospora (Ascomycota, Pezizomycetes) and related species in Australia, with descriptions of the new species P. austroechinospora and P. meridionalis

这篇研究通过多基因座（ITS、28S rRNA、rpb2）系统发育分析和形态学检视，首次在分子层面证实了具刺孢盘菌（P. echinospora）在澳大利亚的存在，并揭示其物种复合群中存在新的谱系，正式描述了两个与火烧地生态相关或可作为内生菌的新物种，为理解该地区盘菌科（Pezizaceae）的多样性、生物地理学和生态功能提供了关键证据。

　　

ABSTRACT

摘要

Peziza echinospora是一种典型的杯状真菌，通常作为腐生菌在火烧地上被发现。它拥有具刺的椭圆形子囊孢子，并具有世界性分布。此前基于形态学研究，澳大利亚曾有该物种的记录，但一直缺乏分子数据的证实。本研究旨在填补这一知识空白，并探究该物种复合群内部的谱系多样性。为此，我们对来自澳大利亚南部的P. echinospora及相关物种进行了物种界定研究，综合运用了核糖体rDNA内转录间隔区ITS1-5.8S-ITS2（ITS）、部分28S rRNA和rpb₂（RNA聚合酶II第二大亚基）基因的多位点系统发育分析，以及对馆藏真菌标本的形态学检视。基于这些分析，我们证实了P. echinospora在澳大利亚的存在，并正式描述了两个新物种：P. austroechinospora和P. meridionalis。其中，P. austroechinospora通常也生长在火烧地上，其子囊孢子具有与P. echinospora相似的刺状纹饰，但尺寸更大、形状更长。而P. meridionalis则具有光滑的子囊孢子，这与北半球的近缘种P. subvesiculosa相似，但其孢子更小，且生态学特性不依赖于火烧土壤。此外，研究还讨论了P. meridionalis作为兰花根部内生菌的可能性。

INTRODUCTION

引言

Peziza echinospora是一种典型的杯状真菌，在欧美地区常被发现于火烧地上。虽然在阿根廷、智利和澳大利亚也曾有过报道，但这些记录大多未经基于系统发育分析的验证。系统发育研究显示，广义的Peziza属是一个多系群，而P. echinospora被置于狭义Peziza（Pezizasensu stricto）之中。Hansen等人的早期工作将狭义Peziza划分为两个主要谱系（A和B），P. echinospora被归入B谱系，该谱系包含了一系列宏观形态差异较大、子囊盘通常较大（>2厘米）且呈深杯状的物种。其孢子纹饰从P. echinospora的规则分离尖刺，到P. arvernensis的相对粗糙、不规则的疣状突起，再到P. varia复合群中光滑或近乎光滑的细密疣点，表现出多样性。

后续研究发现，P. echinospora在系统树上与P. varia复合群构成姊妹群，并与北半球和南美的一些未定名物种以及欧洲的P. subvesiculosa共同形成一个分支。P. subvesiculosa在宏观形态和具光滑大孢子方面与Peziza的模式种P. vesiculosa相似，但其通常在火烧地上被发现，并且在系统发育上明确归属于P. echinospora支系，而非P. vesiculosa所在的A谱系。

在澳大利亚，Rifai于1968年基于维多利亚州的一份标本首次报道了P. echinospora。他注意到澳大利亚标本的子囊孢子比欧洲模式标本略大，可能代表一个地理隔离的分类单元。迄今为止，基于形态学鉴定，澳大利亚已记录了数十份P. echinospora的凭证标本和观察记录，但分子层面的支持数据非常有限。对南半球盘菌科的最新分子研究揭示了该地区先前未被记录的特有物种多样性，同时也证实了一些世界性物种的存在。然而，澳大利亚Peziza物种分子数据的匮乏，限制了我们对该科真菌在澳大利亚的多样性、生物地理学和生态学的理解。

为填补这些知识空白，本研究利用多位点系统发育分析和馆藏标本形态学检视，对澳大利亚的P. echinospora及相关物种进行了物种界定研究。我们的目标包括：（i）确认P. echinospora是否存在于澳大利亚；（ii）鉴定并描述先前在馆藏记录中被忽视的、具有明显形态差异的额外系统发育种。基于形态学和系统发育学分析，我们正式描述了两个新物种：P. austroechinospora和P. meridionalis。

MATERIALS AND METHODS

材料与方法

标本检视

从维多利亚国家植物标本馆（MEL）、墨尔本大学植物标本馆（MELU）、西澳大利亚植物标本馆（PERTH）和南澳大利亚州立植物标本馆（AD）中，选取了鉴定为P. echinospora、P. anthracophila（P. echinospora的同义词）及未定名Pezizasp.的馆藏真菌标本用于DNA测序和微形态学分析。由于初步评估显示与P. subvesiculosa的DNA序列相似性，我们还纳入了这些标本馆中先前鉴定为P. austrogeaster、P. cerea和P. repanda的额外标本。

宏观与微形态学研究

宏观形态描述基于野外记录、标本照片以及对干燥材料的检视。新鲜标本的颜色依据采集者在日光条件下的记录进行描述，并尽可能参考Kornerup和Wanscher的比色卡或爱丁堡皇家植物园出版的《英国真菌颜色识别图》。物种分布图利用“澳大利亚生命图谱”（ALA）空间门户中的Leaflet工具，基于ALA的标本地理位置数据创建。

微形态特征通过使用配备微分干涉对比和数码相机附件的奥林巴斯BX51明场显微镜，对干燥标本的切片进行观察、描述和绘图。子囊盘切片从干燥标本上切下，在H₂O或5% KOH中复水，KOH用于使组织膨胀并观察颜色变化。组织、色素、子囊、子囊孢子、侧丝及外囊盘被菌丝的测量记录于H₂O复水后的制片中。子囊的淀粉质反应在梅泽试剂（MLZ）中观察，样本需先在5% KOH中复水，再用H₂O冲洗以催化反应。子囊孢子测量自至少20个孢子，每个被检视标本至少测量10个子囊。测量结果以被检视标本平均值的范围呈现，其中总体平均值以斜体表示，极端值置于括号内。测量孢子数量和被检视标本数量在方括号中注明。子囊孢子大小范围的可视化绘图在R 4.4.2中完成。所有其他显微测量值以观察到的范围提供。

我们使用扫描电子显微镜（SEM）观察和展示子囊孢子纹饰。将成熟干燥子囊盘的部分在5% KOH中复水以促进子囊开裂和孢子释放，清洗后压碎以悬浮孢子。将含孢子的液滴滴在制备好的样品台上，空气干燥后，在墨尔本大学微生物科学显微镜单元进行金溅射镀膜，随后在维多利亚皇家植物园的日立TM4000Plus II显微镜下观察。

DNA提取、扩增与测序

采用改良的CTAB法从干燥子囊盘组织中提取基因组DNA。使用引物对ITS1F/ITS4和LROR/LR3，分别通过聚合酶链式反应（PCR）扩增核糖体rDNA的内转录间隔区（ITS）和大亚基（28S）rDNA的D1-D2区。PCR在20微升体系中进行，使用MyTaq Red Mix，采用标准三步法循环程序。成功扩增通过凝胶电泳评估。双向测序由澳大利亚基因组研究机构（AGRF）完成，所得色谱图在Geneious Prime 2021.0.3中对齐和手动编辑以生成一致序列。

RNA聚合酶II基因（rpb₂）序列从一个正在进行的盘菌纲（Pezizomycetes）系统基因组学项目中，对澳大利亚的P. austroechinospora、P. meridionalis和P. echinospora标本进行从头基因组组装后提取。所选澳大利亚标本的基因组DNA采用Illumina NovaSeq X平台的150-bp双端测序协议，由Macrogen Oceania公司完成测序。

系统发育分析

将本研究生成的ITS、28S和rpb₂序列，与此前研究中来自其他地理区域的P. echinospora、P. subvesiculosa及相关类群的序列合并。同时，利用Mass BLASTer工具在PlutoF工作台对GenBank和UNITE数据库进行BLAST搜索，获取高度相似的额外序列。我们还查询了GlobalFungi数据库和澳大利亚土壤真菌数据集，以检索可能匹配这些物种的环境ITS序列。我们纳入了P. varia复合群、P. arvernensis和P. vesiculosa的序列，并以Geoscypha属物种作为外群，这是基于此前对盘菌科的系统发育研究。

ITS、28S和rpb₂数据集分别使用MUSCLE进行比对。比对后，将三个数据集连接，并翻译为氨基酸序列以推断编码区（18S、5.8S、28S、rpb₂）的位置。比对结果被修剪以包含部分18S、ITS1-5.8S-ITS2、28S的D1-D2区和rpb₂，并生成分区文件，将每个编码和非编码区作为独立分区。

我们使用命令行版IQ-TREE 2.2.2.6，通过ModelFinder和分区模型，在解耦边的前提下，为每个分区寻找最佳进化模型。为便于后续比较，我们将模型选择限制在MrBayes可用的范围内。根据贝叶斯信息准则（BIC），所有分区合并后的最佳拟合模型是GTR+F+I+G₄。最大似然（ML）系统发育分析使用该模型，分支支持值通过10,000次超快自展法估算。贝叶斯推断（BI）使用MrBayes 3.2.6在Geneious Prime中实现，采用GTR+G₄替换模型，运行200万次马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）迭代。在两种分析中，均以Geoscypha montana作为外群。

RESULTS

结果

系统发育研究

连接的ITS+28S+rpb₂数据集包含了来自14个物种的64份标本的序列，其中包括本研究生成的三个物种的30条新序列。比对后的连接数据集包含3030个字符，其中2273个为恒定位点，497个为简约信息位点。ITS数据集包含751个字符，28S数据集包含634个字符，rpb₂数据集包含1645个字符，各自包含不同数量的恒定位点和简约信息位点。

ML和BI系统发育分析的拓扑结构一致。Peziza属形成一个得到高支持的单系群，与外群Geoscypha构成姊妹群。P. austroechinospora、P. echinospora、P. meridionalis、Pezizasp. d（Hansen等，2002）以及至少四个未确定的Peziza物种共同形成一个支系，该支系是P. varia复合群的姊妹群，这与之前研究记录的关系一致。

具体而言，P. austroechinospora和P. echinospora构成一对姊妹种，且两个支系中都包含了来自澳大利亚标本的序列。这两个物种ITS序列之间的成对相似性为94.39–95.81%。在GlobalFungi和澳大利亚土壤真菌数据集中，没有发现匹配P. echinospora或P. austroechinospora的澳大利亚环境土壤序列。

另一方面，P. meridionalis由澳大利亚标本的序列代表，它是一个得到高支持的单系群，并且是与一个由P. subvesiculosa、Pezizasp. d以及其他来自北半球的未描述物种组成的支系的姊妹群。这个包含上述物种的支系，又是包含P. austroechinospora和P. echinospora的支系的姊妹群。P. meridionalis的ITS序列成对相似性为97.39–100%。值得注意的是，来自澳大利亚的四份杯状P. meridionalis标本的ITS序列，与从南非两种兰花（Corycium ingeanum和C. orobanchoides）根部分离到的四个环境DNA序列高度匹配（成对相似性>98%）。然而，同样在上述环境数据库中，没有发现匹配P. meridionalis的澳大利亚土壤序列。

形态学研究

对澳大利亚标本的形态学检视显示，P. echinospora和P. austroechinospora在宏观和微观形态上高度相似，两者都具有刺状纹饰的子囊孢子。然而，孢子的大小和形状能够清晰地区分这两个物种，子囊盘的大小和颜色也存在差异。具体来说，P. austroechinospora的子囊孢子更大（平均18.22 × 8.67微米）且比例上更长（平均Q值= 2.213），而P. echinospora的子囊孢子较小（平均13.68 × 7.31微米；Q = 1.887）。

相比之下，P. meridionalis具有光滑的椭圆形子囊孢子，这与P. subvesiculosa支系中其他物种的特征一致，但其孢子尺寸略小于已有数据的近缘种。

TAXONOMY

分类学处理

Peziza echinosporaP. Karst.

形态描述（基于澳大利亚标本）：子囊盘地上生，杯状，有时扩展为大型盘状并具上翘边缘，直径可达30毫米；子实层平滑或极细粗糙，光滑，呈浅黄色至棕橙色，有时带绿褐色或黄绿色调；外表面粗糙，具弱小疣，常被白色屑状物。

囊盘被由数层构成。外囊盘被可达50微米宽。子囊圆柱形，8孢，单列，顶部在MLZ中具蓝色淀粉质环（Van Vooren所述的WTR型）。子囊孢子椭圆形，幼时光滑，成熟时具刺，纹饰由规则或不规则的锥形尖刺构成，无色至淡黄色。

分布与生态：通过分子数据确认分布于北美、欧洲和澳大利亚。在澳大利亚，见于近期过火的湿性桉树林中的土壤、落叶层、腐殖质或树桩上。

备注：所检视澳大利亚标本的形态与欧美标本一致。一些标本可能未成熟，其孢子明显较小。成熟的P. echinospora标本的孢子显著小于所有被检的P. austroechinospora标本。除了大小差异，两者孢子纹饰也存在细微差别：P. echinospora的纹饰更尖锐、形状略不规则，而P. austroechinospora的纹饰更规则、通常更低、顶端更圆润。尽管该物种通常见于火烧地，但部分澳大利亚标本采集自落叶层或树桩，其是否与火灾相关尚不确定。

Peziza austroechinosporaL.J. Vaughan, Birch & Truong, sp. nov.

模式：澳大利亚，塔斯马尼亚。主模式保存于MEL 2518939。

鉴别特征：大型、褐色、杯状至平展的子囊盘，常波状起伏；具刺子囊孢子，尺寸（平均18.22 × 8.67微米）和长宽比（平均Q = 2.213）均大于P. echinospora（平均13.68 × 7.31微米；Q = 1.887）；ITS序列与P. echinospora的相似性为94.39–95.81%。

词源：源自拉丁文“australis”（南方的）和希腊文“echinos”（刺猬、刺）及“spora”（孢子），意指其分布于澳大利亚南部，且形态和系统发育位置与P. echinospora相似。

形态描述：子囊盘地上生，幼时杯状，后扩展为平展或波状，常不规则折叠，直径可达40-80毫米；子实层光滑，浅褐色至褐色；外表面粗糙，颜色通常浅于子实层。

子囊圆柱形，8孢，单列，顶部在MLZ中具蓝色淀粉质环（WTR型）。子囊孢子椭圆形，具刺，纹饰为短而规则、顶端圆润的尖刺，无色至淡黄色。

分布与生态：目前已知分布于澳大利亚南部的塔斯马尼亚、维多利亚和西澳大利亚州。生长于火烧地，或近期过火的湿性桉树林中的土壤、木材或树皮上。

备注：Rifai曾检视一份澳大利亚标本，并注意到其孢子（14.5–18.2微米）长于欧洲的P. echinospora等模式标本（13.6–16.3微米），认为可能代表不同物种。其记录的孢子尺寸暗示该标本