《Mycologia》：Filamentous fungal communities associated with the eastern larch beetle (Dendroctonus simplex LeConte) in Minnesota, including new Ophiostomatales species
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本文聚焦美国明尼苏达州东部落叶松小蠹虫（Dendroctonus simplex）爆发区的虫道真菌群落，首次系统揭示了其物种多样性。研究在明尼苏达州7个地点从56棵被侵染的落叶松（Larix laricina）上分离出45种真菌，并基于形态学和系统发育学描述鉴定了4个蛇口壳目（Ophiostomatales）新物种，同时重新分类了先前描述的物种。群落水平分析表明，子囊菌门（Ascomycota）占绝对优势，其中蛇口壳目（尤其Grosmannia americana）是核心功能类群。本研究为理解小蠹虫爆发背景下真菌群落的组成、功能及其潜在生态作用提供了关键基础数据。
引言
小蠹虫（鞘翅目：象甲科：小蠹亚科）与多种真菌存在广泛关联，这些真菌被小蠹虫在树木间传播并定殖于其虫道的韧皮部中。在丰富的真菌群落中，蛇口壳目（Ophiostomatales，子囊菌门）和虫座壳属（Entomocorticium，担子菌门）的物种通常占主导地位。这些真菌在小蠹虫的成功定殖中可能扮演关键角色，例如作为磷和氮的来源补充韧皮部取食小蠹虫的营养，或通过产生挥发物吸引其他小蠹虫发起大规模攻击，甚至发出树木已被过度开发的信号。
东部落叶松小蠹虫是北美本土树栖昆虫，其分布范围与落叶松在北美北部的分布区重合。历史上，其爆发具有间歇性，通常定殖于立枯木或倒木，偶尔杀死受干旱、洪水等非生物胁迫的树木。然而，自2001年以来，在明尼苏达州，东部落叶松小蠹虫经历了一次在波及树木数量和持续时间上都非同寻常的爆发。在2001年至2024年间，它已影响了明尼苏达州超过100万英亩、约90%的落叶松林。与以往不同，当前的爆发可能由气候变暖驱动，使得小蠹虫每年夏季可完成两个世代，从而扩散和攻击树木。
尽管东部落叶松小蠹虫不具备储存和运输共生真菌的特化结构——贮菌器，但已有数份报告记载了从其虫道和小蠹虫体表分离到的真菌。先前在佛蒙特州从东部落叶松小蠹虫成虫和虫道中分离到Graphium simplex（微囊菌目），并根据形态特征将其描述为新种。另一形态相似的物种Ophiostoma americanum（无性型Leptographium americanum，蛇口壳目）也在同期从佛蒙特州落叶松的东部落叶松小蠹虫虫道中被描述，后者后来基于系统发育学被重命名为Grosmannia americana。目前，对于在其分布区五大湖区域，特别是在小蠹虫导致落叶松广泛死亡的时期，东部落叶松小蠹虫虫道中的丝状真菌群落知之甚少。
本研究旨在描述明尼苏达州全境当前爆发期内，与东部落叶松小蠹虫虫道相关的真菌群落。基于形态学和序列数据描述了蛇口壳目中的四个新物种。此外，我们基于先前的形态和序列数据，建议对Graphium simplex进行重新分类。这些结果揭示了东部落叶松小蠹虫虫道内真菌的多样性，为未来研究阐明这些真菌如何促进东部落叶松小蠹虫爆发和落叶松死亡奠定了基础。
材料与方法
野外采集
在2022-2023年，从美国明尼苏达州七个地点的56棵落叶松上的东部落叶松小蠹虫虫道中收集了木屑。根据明尼苏达州自然资源部2022年航空调查数据，将地点按侵染等级分类：三个地点为轻度侵染（1-29%的树木显示东部落叶松小蠹虫症状），三个地点为中度侵染（30-49%），一个地点为严重侵染（≥50%）。
培养
从每个东部落叶松小蠹虫虫道取四块木屑，分别置于含有三种类型真菌生长培养基的培养皿中，以培养代表虫道真菌的多样化群落。使用了麦芽提取物琼脂、放线菌酮培养基和担子菌选择性培养基。培养皿用Parafilm封口，室温储存，每3天检查生长情况。将独特的丝状真菌形态型转接到不含硫酸链霉素的MEA上进行纯培养。本研究中获得的每种蛇口壳目物种的一个分离株保存在美国农业部农业研究服务部菌种保藏中心，保藏号为NRRL 64919–64924。
DNA提取
纯培养物在室温下生长1至2周后，使用Chelex提取法提取DNA。对于初始Chelex提取不成功的分离株，以及所有蛇口壳目分离株，使用另一种提取方法进行二次提取。
PCR与测序
使用引物对ITS1F和ITS4扩增所有分离株的核糖体DNA内转录间隔区ITS1-5.8S-ITS2。对于蛇口壳目，使用另外五对已建立的引物对每个分离株进行鉴定：大亚基rRNA基因座（28S）、β-微管蛋白（TUB2）、延伸因子1-α（EF1-α）、钙调蛋白（CAL）和RNA聚合酶II第二大亚基（RPB2）。使用Bio-Rad T100热循环仪进行PCR扩增，反应条件依据各引物对的既定方案。扩增子通过凝胶电泳可视化，并使用桑格测序法完成测序。
真菌群落分析
使用Geneious Prime软件对序列进行修剪，并使用BLASTn与已发表序列进行比较。使用R语言中的iNEXT软件包创建总体样本完整性曲线。使用R语言中的FUNGuild软件包为每个属分配功能特征，排除了“软腐”特征，并创建了新特征“昆虫病原菌”以包含已知的小蠹虫病原真菌科——虫草科。使用lme4软件包中的线性混合模型比较各地点属和特征的丰度，将“地点”作为随机效应项。
蛇口壳目的系统发育定位
使用Geneious Prime软件对蛇口壳目序列进行修剪，并使用MAFFT在线工具与参考序列进行比对。使用Gblocks处理比对后的序列。比对后，在R语言中使用ape软件包对位点进行串联和修剪。使用IQ-TREE在线版进行最大似然分析，使用1000次自举重复和GTR核苷酸模型。使用MrBayes软件进行贝叶斯推断分析。为了评估Graphium simplex的系统发育位置并作为外群，系统发育树中还纳入了Graphium penicillioides（Graphium属的模式种）、从美国一种Ambrosia小蠹环境中分离的Graphium euwallaceae、从奥地利欧洲落叶松分离的Graphium laricis，以及从美国湿地松分离的一个Graphium物种。最终使用最大似然和贝叶斯推断的输出结果，在R语言中使用ggtree软件包构建了串联系统发育树。
新蛇口壳目物种的描述
通过将每个物种的三个重复分离株接种到MEA和放线菌酮培养基上测定生长速率。从活跃生长的菌落边缘取一个5×5 mm的菌块置于每个平板中央，在黑暗室温下培养7天后，使用数显卡尺测量两个相隔90°角方向的径向生长。
为了描述形态特征，在MEA上培养14天后拍摄各蛇口壳目物种的俯视照片。尝试将所有可能成对的同一物种分离株共同培养5周，检查是否产生子囊壳。还在添加了灭菌的白松和黑云杉木屑的MEA上培养每个蛇口壳目分离株，以观察木材是否能诱导子囊壳或束丝产生。
对于显微测量，将结构置于水中制片，每个物种的每种结构在可用时测量50个重复。各种结构的尺寸列出为最小值-最大值（平均值±标准差）。使用奥林巴斯BX41TF显微镜拍摄真菌结构的照片。
结果
真菌群落分析
从明尼苏达州小蠹虫当前爆发区七个地点的东部落叶松小蠹虫虫道中，共回收了203个真菌分离株。本研究达到了87.24%的总体样本覆盖度。将本研究的分离株数量加倍可将覆盖度提高到94.54%。分离出的真菌代表了4个门、16个目、26个科、35个属和45个物种。大多数（82%）分离株属于子囊菌门（26个物种），其次是担子菌门（占12%，包含13个物种）。其余5%的分离株属于被孢霉门（2个物种）和毛霉门（4个物种）。
蛇口壳目是子囊菌门中的优势类群，包含6个物种，占总分离株的59%。一个属，Grosmannia，的分离频率显著高于任何其他属。Grosmannia americana alone占据了所有分离株的52%（106个分离株），并从56棵树中的42棵中被回收。除严重侵染的Itasca 3地点（该地点含有蛇口壳目物种Sporothrix gossypina和新种Ophiostoma itasca）外，其他所有地点均回收到了该物种。基于FUNGuild特征和先前研究的功能分组显示，蓝变菌（蛇口壳目）的丰度显著高于褐腐菌、昆虫病原菌和白腐菌。
蛇口壳目的系统发育定位
基于六个位点串联数据集的系统发育分析，本研究中分离的两个物种与已描述的蛇口壳目物种匹配。本研究中分离的一个物种与先前在美国佛蒙特州分离的Grosmannia americana分离株匹配。另一组分离株被鉴定为Sporothrix gossypina，与美国新墨西哥州西黄松的一个分离株亲缘关系密切。此外，分离株还形成了四个得到良好支持的进化支，对应本文描述的四个未命名新物种：属于O. minus物种复合群的Ophiostoma itasca, sp. nov.和O. minnesotense, sp. nov.，属于O. ips物种复合群的O. pseudoips, sp. nov.，以及Graphilbum insulare, sp. nov.。基于系统发育学和形态特征，确定Graphium simplex应被重新分类为Leptographium simplex, comb. nov.。
新分类单元描述
- 1.
Graphilbum insulare, sp. nov. 模式标本保存于NRRL 64919。与Graphilbum nigrum和G. acuminatum遗传相似，但在分生孢子大小、菌落形态和生长速率上存在差异。分生孢子透明，单细胞，光滑，长圆形，常于截形基部渐细。在MEA上菌落平坦、圆形、扩展，边缘平滑，生长速率为1.93±0.29 mm/天。
- 2.
Ophiostoma itasca, sp. nov. 模式标本保存于NRRL 64924。与O. wuyingense、O. kryptum和O. minnesotense, sp. nov.遗传相似，但在关键形态特征上不同。具有leptographium-like的分生孢子梗，分生孢子更大。菌落平坦，扩展，边缘不规则、叶状，生长速率为3.18±1.95 mm/天。
- 3.
Ophiostoma minnesotense, sp. nov. 模式标本保存于NRRL 64922。与O. wuyingense和O. itasca, sp. nov.遗传相似，但存在关键的形态和生态差异。具有hyalorhinocladiella-like的分生孢子梗。分生孢子透明，单细胞，光滑，圆形至长圆形。菌落平坦，大部分沉没在培养基中，圆形，边缘平滑，生长速率为5.08±0.75 mm/天。
- 4.
Ophiostoma pseudoips, sp. nov. 模式标本保存于NRRL 64920。与O. adjuncti和O. pulvinisporum遗传相似，但在一些关键形态特征上不同。具有hyalorhinocladiella-like的分生孢子梗。分生孢子透明，单细胞，光滑，椭圆形。菌落表面和沉没生长，扩展，边缘平滑、略不规则，生长速率为13.29 mm/天。
- 5.
Leptographium simplex, comb. nov. 基于系统发育数据，该物种归于Leptographium serpens复合群。先前根据形态特征被定为Graphium simplex，后因Graphium复合群被重新分类入微囊菌目。其形态特征如具有黑色球状颈部的子囊壳以及在较高浓度放线菌酮上生长的能力，也与蛇口壳目物种一致。
讨论
本研究基于形态学和多位点系统发育分析，从东部落叶松小蠹虫虫道中鉴定出四个新的蛇口壳目物种。这些新物种归于Graphilbum属和Ophiostoma属。据我们所知，这是首次从落叶松属植物中分离到Graphilbum物种。两个新描述物种属于Ophiostoma minus复合群，该复合群也包括从欧洲落叶松中分离的O. kryptum。Ophiostoma ips已被广泛从小蠹虫环境中分离，但Ophiostoma pseudoips, sp. nov.与O. ips及其他已描述的Ophiostoma物种明显不同。与落叶松相关的真菌研究甚少，可能还有许多新物种有待从该系统中描述。
尽管我们的分离株与美国佛蒙特州东部落叶松小蠹虫虫道中先前收集的Graphium simplex分离株相似性均未超过96.5%，但我们建议对该物种进行重新分类。先前在L. simplex原始描述之后进行的系统发育工作得出结论，尽管Graphium属物种在形态上与某些蛇口壳目相似，但它们属于微囊菌目。基于其与Leptographium yamaokae和L. francke-grosmanniae模式标本的系统发育关系，我们确定Graphium simplex与Leptographium是同属的，并提出了新组合Leptographium simplex, comb. nov.。
我们的研究结果表明，Grosmannia americana在明尼苏达州全境的东部落叶松小蠹虫虫道中丰度极高。该物种先前被描述为东部落叶松小蠹虫的共生菌，但其分布范围和在其虫道中相对于其他真菌的丰度存在不确定性。我们在G. americana分离株中未发现遗传变异，并且我们的分离株基于CAL和RPB2位点与佛蒙特州分离株近乎完全匹配。除钙调蛋白位点外，它们在每个位点上也与Grosmannia abietina高度相似（>98.5%）。云杉小蠹虫在北美与G. abietina高度相关。研究表明，G. abietina可能帮助云杉小蠹虫定殖树木，并且一些分离株似乎对云杉树苗具有致病性。G. abietina也与黄杉小蠹虫有关联。值得注意的是，在2001年和2002年，在明尼苏达州落叶松林中，于其寄主物种花旗松和西方落叶松分布区之外，曾用漏斗诱捕器捕获到黄杉小蠹虫。目前尚不清楚黄杉小蠹虫是否将其任何共生真菌引入了明尼苏达州的落叶松林，因为本研究中分离的所有真菌均不同于黄杉小蠹虫的共生菌G. abietina和Ophiostoma pseudotsugae。在我
