《Mycology》：CRISPR/Cas9 nickase-mediated cytosine base editing in Trichoderma koningiopsis
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本文系统性地报道了两种胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor, CBE）在丝状真菌康宁木霉（Trichoderma koningiopsis）中的成功构建与应用。研究首次将高效的mini-SDD7去氨酶引入木霉属真菌，实现了单碱基精准编辑（最高效率达80%），并突破了该领域多重基因编辑的技术瓶颈，成功完成了双基因与三基因的同时定点失活。该工作为木霉乃至其他丝状真菌的精准基因组工程提供了高效、便捷的新工具，并通过编辑纤维素酶生产相关调控基因，直接获得了高产纤维素酶和木聚糖酶的工业菌株，展示了碱基编辑技术在工业微生物代谢工程与合成生物学领域的巨大应用潜力。
引言：精准基因组编辑新工具在丝状真菌中的机遇与挑战
近年来，可编程的基因组编辑技术深刻改变了生物学研究与代谢工程领域。其中，CRISPR/Cas9切口酶介导的碱基编辑器是一项重要创新，它能够在无需造成DNA双链断裂（DSBs）或提供供体DNA模板的情况下，实现精确的单核苷酸替换。典型的碱基编辑器主要由三个关键组件构成：催化失活的Cas9变体（dCas9或nCas9）、碱基修饰酶和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）。根据碱基修饰酶的不同，碱基编辑器主要分为胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。CBE系统通过将胞嘧啶核苷脱氨酶与nCas9或dCas9融合形成效应蛋白，在单向导RNA（sgRNA）的精确引导下，催化靶位点特定区域内胞嘧啶核苷（C）脱氨基转化为尿嘧啶核苷（U），随后通过DNA复制和修复机制，最终完成目标DNA序列中C到T的转换。UGI的作用是抑制不必要的碱基切除修复。
然而，尽管碱基编辑器在动植物和哺乳动物细胞中应用广泛，其在丝状真菌，特别是木霉属（Trichoderma）中的应用仍处于欠开发状态。木霉属真菌以其强大的纤维素和半纤维素降解能力而闻名，是工业酶制剂生产的重要菌种。其中，康宁木霉因其卓越的产酶能力而成为一个极具潜力的工业候选菌株。然而，对木霉进行遗传操作的困难极大地阻碍了其定向和理性的遗传改良。因此，开发适用于木霉的高效、精准的碱基编辑工具具有重要的科学与应用价值。
材料与方法：构建与评估适用于康宁木霉的CBE系统
本研究旨在为康宁木霉开发一套高效的基因组编辑工具。研究人员构建了两种基于nCas9（D10A）的胞嘧啶碱基编辑系统，分别命名为rAPOBEC1-CBE和mini-SDD7-CBE。这两种系统的主要区别在于所使用的胞嘧啶脱氨酶：rAPOBEC1-CBE使用大鼠来源的APOBEC1脱氨酶，而mini-SDD7-CBE则使用了来源于细菌Kribbella voronezhensis、并经过截短优化的mini-SDD7脱氨酶。该脱氨酶此前在水稻和人类细胞中已显示出高于rAPOBEC1的编辑活性，且无明显序列背景偏好性。
两种CBE系统的表达框架被构建在含有AMA1自主复制序列和潮霉素（Hyg）抗性筛选标记的质粒上。融合蛋白（脱氨酶-nCas9-UGI）的表达由来自构巢曲霉的gpdA启动子驱动。为表达sgRNA，研究者选择了康宁木霉自身的甘氨酸tRNA作为启动子，以确保在真菌细胞中的高效转录。
构建完成的质粒通过PEG介导的原生质体转化法转入康宁木霉。转化子经过筛选和测序验证，以计算编辑效率。此外，研究还通过Cas-OFFinder工具预测潜在脱靶位点，并利用Sanger测序结合TIDE算法进行分析，以评估编辑系统的特异性。
结果：mini-SDD7-CBE系统展现高效编辑能力
3.1 编辑效率的初步评估与比较
为测试两个CBE系统的编辑效率，研究首先选择了乳清酸核苷-5‘-磷酸脱羧酶基因ura5和丝氨酸蛋白激酶基因yak1作为靶点。结果显示，对于ura5基因，rAPOBEC1-CBE和mini-SDD7-CBE的编辑效率分别为11.1%和13.6%，差异不大。然而，在编辑yak1基因时，两个系统表现出了显著差异：rAPOBEC1-CBE的编辑效率仅为12.5%，而mini-SDD7-CBE的编辑效率高达81.5%。这一结果凸显了mini-SDD7脱氨酶在康宁木霉中的高效性。
ura5基因位点编辑序列比对。(b) yak1基因位点编辑序列比对。">
序列分析表明，mini-SDD7-CBE在康宁木霉中的编辑窗口主要位于PAM序列上游第16至20位核苷酸之间，这与在人类细胞中观察到的结果（第10至20位）基本一致。同时，研究也发现了一些非预期的C-to-A/G转换或碱基缺失，推测可能是由于脱氨酶在多位点发挥作用，激活了多种DNA修复途径（如易错跨损伤合成或非同性末端连接NHEJ）所致。针对yak1靶点sgRNA的脱靶分析显示，在预测的25个潜在脱靶位点均未检测到具有统计学意义的插入缺失（indel）事件，表明该系统的脱靶效应较低。
3.2 编辑系统的扩展应用与特性分析
为进一步验证mini-SDD7-CBE系统的适用性，研究将其应用于另外两个与纤维素酶生产调控相关的基因：转录抑制因子基因ace1和一个推测的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因pk1。编辑效率分别为15%和10%。结合之前的结果，研究发现mini-SDD7-CBE的编辑效率受sgRNA的兼容性和靶位点的染色质可及性影响显著，不同靶点间的效率差异很大（从10%到80%以上）。
3.3 实现多重基因编辑突破
利用mini-SDD7-CBE系统在单基因编辑中表现出的高效性，研究者评估了其在康宁木霉中进行多重基因编辑的潜力。通过将靶向不同基因的sgRNA表达盒以串联方式构建在同一质粒上，研究成功实现了ace1和yak1的双基因同时编辑，效率为10%；以及pk1、ace1和yak1的三基因同时编辑，效率为13%。
ace1或pk1基因位点编辑序列比对。(b) 双基因编辑质粒pTK-tRNA(Gly)-Ace1-Yak1-SDD7示意图。(c) 三基因编辑质粒pTK-tRNA(Gly)-Pk1-Ace1-Yak1-SDD7示意图。">
一个关键发现是，多重编辑的总体效率主要由效率最低的那个sgRNA决定，而非所有sgRNA效率的叠加或平均值。在双基因编辑中，尽管yak1的单基因编辑效率很高，但双基因同时编辑的效率（10%）更接近于效率较低的ace1靶点（10%）。在三基因编辑中，总体效率也与效率最低的靶点（ace1和pk1，~10%）相近。这表明在多重编辑中，可能存在多个sgRNA对Cas-脱氨酶复合物的竞争，以及位点特异性的可及性或修复动力学差异。
3.4 获得高产酶工业菌株
通过对编辑获得的多种单基因、双基因及三基因缺失突变株进行酶活分析，研究成功获得了具有优良性状的工业菌株。结果表明，yak1缺失株（Δyak1）的羧甲基纤维素酶（CMCase）和木聚糖酶产量分别比野生型（WT）提高了1.6倍和1.3倍，是一个高产纤维素酶和木聚糖酶的菌株。
cbh1, cbh2, eg1, eg2, bgl1）和木聚糖酶基因（xyn1, xyn2, bxl）的相对转录水平。">
相反，pk1缺失株（Δpk1）的表现则更为复杂：其木聚糖酶产量增加了超过两倍，但纤维素酶产量却显著下降。转录组分析显示，Δpk1中主要纤维素酶基因（cbh1, cbh2, eg2）的表达被显著抑制，而木聚糖酶基因（xyn1, xyn2, bxl）的表达则被强烈诱导（上调约10倍）。此外，Δpk1菌株在固体培养基上的生长也受到损害。这些结果表明，pk1（可能作为MAPK）在康宁木霉中参与了复杂的调控网络，对纤维素酶和木聚糖酶基因的表达具有相反的调控作用，并影响菌体的基本生理活动。
讨论与结论：为丝状真菌精准工程提供强大新工具
本研究首次在木霉属真菌中成功构建并应用了基于mini-SDD7脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑系统。与传统的rAPOBEC1-CBE相比，mini-SDD7-CBE在康宁木霉中显示出更高的编辑效率（对yak1高达80%）和更广的适用性。更重要的是，该研究首次在丝状真菌中实现了基于CBE的多重基因同时编辑，突破了该领域的一项技术瓶颈。
尽管系统表现出高效性，但仍存在优化空间。例如，在高效编辑位点观察到的非预期碱基转换或缺失，提示可能需要增强UGI的表达以更有效地抑制尿嘧啶切除修复，或抑制NHEJ修复途径来提高编辑保真度。此外，不同靶点间编辑效率的巨大差异主要归因于sgRNA本身的效率差异和靶位点的可及性。未来通过优化sgRNA设计、提高UGI拷贝数、利用多tRNA阵列释放sgRNA等策略，有望进一步提升编辑效率，特别是多重编辑的效率。
在应用层面，研究利用该编辑系统，通过对纤维素酶生产调控网络的精准干预，快速获得了高产纤维素酶（Δyak1）和高产木聚糖酶（Δpk1及Δyak1Δace1Δpk1）的工业菌株。这不仅验证了编辑工具的有效性，也展示了碱基编辑器在工业微生物菌种定向选育中的巨大价值。特别是对pk1基因功能的初步揭示，表明其可能通过类似细胞壁完整性（CWI）的MAPK通路，差异性地调控不同类型的碳水化合物活性酶（CAZyme）基因表达，这为理解丝状真菌复杂的产酶调控网络提供了新线索。
总之，该研究为木霉乃至其他丝状真菌的基因组精确工程提供了一个高效、便捷且可多重化的强大新工具。这种无需引入双链断裂的、可进行多位点特异性的氨基酸编辑技术，不仅将极大促进丝状真菌的功能基因组学研究，也为工业酶制剂、生物燃料、生物基化学品等领域的微生物细胞工厂的理性设计与高效构建开辟了新途径。
