《Mycology》：Sesquiterpene synthases from Inonotus obliquus: functional characterization and β-farnesene production
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本研究以药用真菌桦褐孔菌(Inonotus obliquus)的基因组为基础，功能性鉴定了其17个倍半萜合酶(Sesquiterpene synthases, IoSTSs)。通过米曲霉(Aspergillus oryzae)异源表达与体外酶活验证，明确了八个IoSTSs的功能，其中关键酶IoSTS3、IoSTS16和IoSTS18分别为(+)-异愈创木烯、(?)-胡萝卜烯和β-法尼烯合酶。通过代谢工程手段在工程菌株中过表达甲羟戊酸通路(MVA pathway)关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)和法尼基焦磷酸合酶(FPPS)，成功将β-法尼烯产量提升了58%，达到206.98 mg/kg。该工作不仅拓宽了对真菌倍半萜合酶功能多样性的认知，也为利用微生物底盘可持续生产高价值萜类化合物提供了新策略。
桦褐孔菌倍半萜合酶基因组的挖掘与系统发育分析
前期研究通过二代和三代测序技术获得了桦褐孔菌(I. obliquus)的基因组，并从中预测了20个倍半萜合酶(Sesquiterpene synthase, STS)基因，命名为IoSTS1-20。序列分析显示，所有IoSTSs均属于I型STS，通常包含DD(E)XXD、NSE和RY等保守基序，但也存在一些变异。通过构建系统进化树，并将IoSTSs与来自其他担子菌（如糙皮侧耳、毛韧革菌、金针菇等）的已知STS进行比较，发现IoSTSs主要分布于四个不同的环化分支（Clade）。其中，IoSTS1-7属于分支III（1,11-FPP环化型），IoSTS9和IoSTS19属于分支I（1,10-FPP环化型），IoSTS10-18及IoSTS20属于分支II（1,10-NPP环化型），而IoSTS8则单独属于分支IV（1,6-NPP环化型）。这预示着它们可能催化产生结构多样的倍半萜产物。
关键IoSTSs在米曲霉中的异源表达与功能初筛
为了探究这17个候选基因（IoSTS1-14, 16, 18, 19）的功能，研究团队利用米曲霉(A. oryzae)作为异源表达宿主，构建了相应的重组菌株(AO-IoSTSx)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析其发酵提取物，并与野生型米曲霉对照比较，成功鉴定出八个具有活性的IoSTSs，它们能催化产生15种不同的倍半萜化合物。这些产物大多数为双环倍半萜，少数为链状结构。具体而言：
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AO-IoSTS2主要产生新中介醇(neointermedeol)，并伴有少量γ-杜松烯(γ-cadinene)和瓦伦西亚烯(valencene)。
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AO-IoSTS3专一性地产生(+)-异愈创木烯((+)-isoguaiene)。
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AO-IoSTS6产生1,3,4,5,6,7-六氢-2,5,5-三甲基-2H-2,4a-乙桥萘。
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AO-IoSTS9产生α-杜松醇(α-cadinol)。
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AO-IoSTS10产生链状倍半萜橙花叔醇(nerolidol)。
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AO-IoSTS11产生α-古巴烯(α-copaene)和杜纳-3,9-二烯(cadina-3,9-diene)。
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AO-IoSTS16产生五种化合物，其中主要产物为(?)-胡萝卜烯((?)-daucene)，其余为γ-杜松烯、β-菖蒲二烯(β-acoradiene)、β-榄香烯(β-elemene)和β-古巴烯(β-copaene)。
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AO-IoSTS18产生链状倍半萜β-法尼烯(β-farnesene)。
其余基因在米曲霉中未检测到新的代谢物产生。
体外酶活实验验证关键IoSTS功能
为确证上述基因的功能，研究进一步在大肠杆菌(E. coli)中表达并纯化了10个可溶的IoSTS重组蛋白。其中6个蛋白（IoSTS3, 6, 9, 11, 16, 18）在体外与底物法尼基焦磷酸(FPP)孵育后，显示出催化活性，其产物谱与在米曲霉中的体内表达结果基本一致，从而确证了它们是功能性的倍半萜合酶。值得注意的是，IoSTS9在体外反应中除产生α-杜松醇外，还检测到了吉马烷D-4-醇(germacrene D-4-ol)，但在米曲霉体内只检测到前者，推测可能是由于真菌细胞内复杂环境导致后者不稳定或被快速代谢。其余四个可溶蛋白（IoSTS8, 12, 13, 14）在体外未检测到产物，与其在米曲霉中无活性的结果相符。
关键倍半萜产物的结构鉴定
为进一步验证功能，研究选取了产量较高且具有潜在价值的三种主要产物进行大规模发酵、分离纯化，并通过核磁共振(NMR)谱图鉴定了它们的结构。结果表明，AO-IoSTS3、AO-IoSTS16和AO-IoSTS18的主要产物分别是(+)-异愈创木烯、(?)-胡萝卜烯和β-法尼烯。这一结果从结构化学层面确凿地证明了IoSTS3、IoSTS16和IoSTS18的催化功能。
通过代谢工程提升β-法尼烯产量
β-法尼烯是一种重要的平台化合物，在生物燃料、香料、医药前体和农业信息素等领域具有广泛应用前景。为提高其产量，研究团队在表达IoSTS18的米曲霉菌株基础上，进行了代谢工程改造。通过共表达来自米曲霉自身的甲羟戊酸(MVA)途径中的两个关键酶基因：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)和法尼基焦磷酸合酶(FPPS)，以增强前体供应。实验构建了不同基因组合的工程菌株，并测定了其β-法尼烯产量。结果显示，与仅表达IoSTS18的基础菌株（产量130.50 mg/kg）相比，单独过表达FPPS对产量提升效果不显著，单独过表达HMGR可将产量提升至170.20 mg/kg，而同时过表达HMGR和FPPS则能最大程度地将产量提升至206.98 mg/kg，增幅达58%。这证明了在米曲霉底盘细胞中强化MVA途径是提高目标萜类化合物产量的有效策略。
讨论与意义
本研究系统地表征了桦褐孔菌来源的倍半萜合酶，成功鉴定出多个具有新颖催化功能的酶，特别是(+)-异愈创木烯合酶(IoSTS3)、(?)-胡萝卜烯合酶(IoSTS16)和β-法尼烯合酶(IoSTS18)。这些酶催化的产物，如桉叶烷型、愈创木烷型、杜松烷型和胡萝卜烷型倍半萜，在真菌中较为罕见，其生物合成途径的阐明丰富了对真菌次生代谢多样性的认识。研究提出的生物合成途径假设，例如IoSTS2、3、6通过1,11-环化形成吉马烷中间体，再进一步重排产生桉叶烷或愈创木烷骨架，与植物中相关机制有相似之处，为理解萜类合酶的进化与催化机制提供了线索。
此外，鉴定出的产物如橙花叔醇、(?)-胡萝卜烯等，在植物中已知具有化学防御功能，推测它们在桦褐孔菌的生长发育和生态互作中可能扮演着类似的角色。最重要的是，本研究不仅发现了一个新的真菌来源β-法尼烯合酶，还通过简单的代谢工程策略在丝状真菌米曲霉中实现了该化合物的产量提升，展示了利用丝状真菌作为“细胞工厂”生产高价值萜类化合物的潜力。尽管目前产量与传统酵母工程菌相比仍有差距，但该工作为后续进一步优化发酵工艺、组合更多代谢工程策略奠定了基础，也为从药用真菌中挖掘和利用其生物合成能力开辟了可持续的新途径。
