《Mycology》：Metabologenomic profiling of the endemic Australian fungus Aspergillus luteorubrus
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本研究通过对澳大利亚特有真菌Aspergillus luteorubrus进行全面的代谢基因组学分析，揭示了其丰富的次级代谢潜力。研究者成功分离鉴定了包括新化合物luteolactone A在内的10个代谢物，并通过基因组测序与生物合成基因簇（BGC）分析，将其中的8个代谢物关联至对应的基因簇。该工作不仅展现了该物种独特的生物合成能力，为后续的基因组挖掘和新型次级代谢物发现奠定了基础，也凸显了整合化学与基因组学方法在真菌天然产物研究中的重要性。
澳大利亚特有真菌Aspergillus luteorubrus的全面代谢基因组学剖析
1. 引言
丝状真菌是重要的次级代谢产物（SM）生产者，尤其是曲霉属（Aspergillus）真菌，是生物活性化合物的丰富来源，在制药和生物技术领域具有重要价值。基因组测序显示，曲霉属真菌中检测到的生物合成基因簇（BGC）数量远超其实际产生的次级代谢物数量，表明其生物合成潜力远未被完全开发。许多BGC处于沉默或低表达状态，这为通过基因组挖掘、通路激活或异源表达来揭示其隐藏的化学多样性提供了机遇。本研究团队持续关注澳大利亚特有的稀有曲霉物种，最新描述了一个从澳大利亚昆士兰州白山区国家公园土壤样本中分离得到的新物种——Aspergillus luteorubrusMST-FP2246。为了解其化学分类学特征并进一步开发其生物合成潜力，本文对该菌种进行了广泛的代谢基因组学评估。
2. 材料与方法
研究对A. luteorubrusMST-FP2246在多种培养基上进行培养，发现以巴斯马蒂米和碎小麦为基础的谷物培养基支持了更高的真菌生长和代谢物产量。通过大规模的培养、提取（使用丙酮和乙酸乙酯）、分馏（使用Sephadex LH-20柱色谱）和纯化（使用制备型高效液相色谱），最终从培养物中分离得到十个代谢物。其中包括一个新化合物——luteolactone A (1)，以及九个已知化合物：dimethoxyphthalide (2)、marilone B (3)、(+)-dihydrocanadensolide (4)、ascosteroside C (5)、ascosteroside D (6)、viridicatumtoxin A (7)、aszonalenin (8)、6-hydroxyaszonalenin (9)和近期报道的聚酮苷luteodienoside A (10)。化合物结构通过详细的光谱分析（包括UV、ECD、IR、NMR、HRMS）以及与文献数据或商品标准品对比进行鉴定。对新化合物1的绝对构型通过分子建模和计算电子圆二色谱（ECD）进行了确定。
在生物活性测试方面，对分离的代谢物进行了针对细菌（Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus）、酵母（Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae）、植物（Eragrostis tef）和小鼠骨髓瘤细胞（NS-1）的多种生物活性筛选，以评估其细胞毒性、抗菌、抗真菌和除草潜力。
在基因组学方面，对A. luteorubrus进行了基因组DNA提取、Illumina HiSeq测序，并使用AAFTF管道进行组装。使用antiSMASH 7.0软件对基因组进行次级代谢物BGC分析，鉴定出42个BGC。通过比较基因组学工具（如cblaster, clinker, BiG-SCAPE）和MIBiG数据库，对BGC进行注释和比较分析。此外，还使用dbCAN3服务器分析了其碳水化合物活性酶（CAZyme）的组成。
3. 结果与讨论
3.1. 丰富的生物合成基因簇分析
对A. luteorubrusMST-FP2246基因组的分析揭示了其丰富的生物合成潜力，共鉴定出42个BGC。其中，有19个BGC编码聚酮合酶（PKS），包括8个高还原型PKS（HR-PKS）、8个非还原型PKS（NR-PKS）和3个PKS-NRPS杂合体。此外，基因组还包含编码非核糖体肽合成酶（NRPS，包括8个多模块NRPS和8个NRPS-like蛋白）、8个萜类生物合成以及4个核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPP）的BGC。这表明该真菌具有生产超过40种代谢物的潜力，但目前仅从培养物中鉴定出10种，意味着大量BGC仍处于沉默状态，是发现新代谢物的机会。
3.2. 与烟曲霉复合体其他物种的比较
将A. luteorubrus的BGC与烟曲霉复合体（Fumigatisection）的其他物种（如A. fumigatus, A. hiratsukae等）进行比较，发现其BGC组成具有独特性。BiG-SCAPE分析将所有物种的BGC归入245个基因簇家族（GCF），A. luteorubrus拥有27个该物种特有的GCF。有趣的是，基于GCF的物种聚类与基于传统分子标记的系统发育关系并不完全一致，表明BGC在这些物种中的获得和丢失可能不完全遵循其种系发生史。在CAZyme组成上，A. luteorubrus与其他物种也存在差异，例如其糖苷水解酶（GH）数量最少，这可能反映了其对特定生态位的适应。值得注意的是，A. luteorubrus是所比较物种中唯一拥有能够产生luteodienoside A（含有罕见的糖苷结构）和viridicatumtoxin A的BGC的物种，凸显了其独特的化学多样性。
3.3. 对真菌毒素BGC的筛查
虽然A. luteorubrus属于已知能产生多种真菌毒素的烟曲霉复合体，但基因组分析显示，它含有与aszonalenin（8和9）和viridicatumtoxin A（7）生物合成相关的BGC，但缺乏与gliotoxin和trypacidin生物合成相关的同源BGC。这表明A. luteorubrus的代谢物谱不同于该复合体中的其他一些物种，进一步支持了化学分类学在真菌物种鉴定中的价值。
3.4. 将分离代谢物映射至推定BGC
通过生物信息学分析与已有知识，成功将10个分离代谢物中的8个映射到A. luteorubrus基因组中的推定BGC上：
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化合物1, 2, 3（phthalide类）：映射至一个含有NR-PKS、细胞色素P450单加氧酶和O-甲基转移酶的BGC，与霉菌酸（MPA）生物合成途径类似。
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化合物4（dihydrocanadensolide）：推定其BGC包含脂肪酸合酶（FAS）和柠檬酸合酶（CS），与已报道的sporothriolide生物合成基因簇（spoBGC）具有相似性。
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化合物7（viridicatumtoxin A）：鉴定出完整的vrtBGC同源簇，包含NR-PKS、乙酰乙酰-CoA合成酶、芳香族异戊二烯基转移酶等多种修饰酶，与来自Penicillium aethiopicum的已知簇高度同源。
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化合物8和9（aszonalenin类）：鉴定出含有NRPS（AnaPS同源物）和异戊二烯基转移酶（AnaPT同源物）的BGC，与A. fischeri中的anaBGC同源。
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化合物10（luteodienoside A）：此前研究已鉴定了其ltbBGC，该簇编码一个带有肉碱O-酰基转移酶结构域的HR-PKS（LtbA）和一个糖基转移酶（LtbB）。
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化合物5和6（ascosteroside类）：虽然鉴定出角鲨烯环化酶同源基因，但未发现与糖基转移酶共定位，因此未能确定其明确的BGC。
3.5. 分离代谢物的生物活性
生物活性筛选结果显示：
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化合物6（ascosteroside D）表现出强效的抗真菌活性，对S. cerevisiae的最低抑菌浓度（MIC）为0.2 μg/mL，强于阳性对照blasticidin S HCl，同时对NS-1细胞无显著毒性。
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化合物5（ascosteroside C）对S. cerevisiae有中等抗真菌活性（MIC 3.1 μg/mL）。
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化合物7（viridicatumtoxin A）对测试的革兰氏阳性菌（B. subtilis和S. aureus）具有强效抗菌活性，且对NS-1细胞有中等细胞毒性（IC50为16 μmol/L）。
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化合物9（6-hydroxyaszonalenin）对NS-1细胞显示出强效细胞毒性（IC50为1.5 μmol/L）。
其他测试化合物未表现出显著的生物活性。
4. 结论
本研究通过对澳大利亚特有真菌A. luteorubrusMST-FP2246的综合代谢基因组学分析，系统揭示了其丰富的次级代谢产物多样性及巨大的生物合成潜力。研究成功分离鉴定了包括一个新化合物在内的十种代谢物，并通过基因组学方法将其大部分与特定的生物合成基因簇相关联。与近缘物种的比较基因组学分析，进一步凸显了A. luteorubrus在BGC和CAZyme组成上的独特性，明确了其在烟曲霉复合体中的特殊化学分类学地位。该工作不仅为理解该物种的次级代谢蓝图和生态功能提供了基础，也展示了整合化学分析与基因组学手段在挖掘真菌“隐性”代谢潜力方面的强大能力。A. luteorubrus基因组中大量未表征的BGC，使其成为未来通过基因组挖掘发现新型天然产物的一个极具前景的目标。
