《Mycology》：Molecular mechanisms underlying the inhibition of Sparassis latifolia mycelial growth by cycloleucine: a comprehensive transcriptomic and m6A methylome analysis
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本研究整合了转录组学与m6A甲基化组学（meRIP-seq），首次揭示了食用菌绣球菌（Sparassis latifolia）菌丝生长受环亮氨酸（cycloleucine）抑制的分子机制。研究发现，环亮氨酸通过降低全局RNA m6A水平，调控凋亡诱导因子1（aif1）等67个差异甲基化基因，从而影响菌丝生长。该工作为理解真菌表观转录组学（epitranscriptomics）在生长调控中的作用提供了新证据，并为优化工业栽培提供了潜在靶点。
环亮氨酸抑制绣球菌菌丝生长
绣球菌（Sparassis latifolia）是一种珍贵的食药用菌，但其菌丝生长缓慢，制约了其工业化栽培。环亮氨酸是一种非蛋白原性氨基酸，已知是S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖性甲基转移酶的竞争性抑制剂，可影响多种生物的生长和RNA甲基化。本研究旨在通过整合转录组学和m6A（N6-甲基腺苷）甲基化组学分析，阐明环亮氨酸抑制绣球菌菌丝生长的分子机制。
1. 环亮氨酸抑制菌丝生长与m6A甲基化水平
研究发现，环亮氨酸以浓度依赖的方式显著抑制绣球菌的菌丝生长和生物量积累。浓度为10 mmol/L时，抑制率接近50%，且在此浓度下，菌丝生物量显著减少。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测多种RNA修饰水平，结果表明，在环亮氨酸处理下，只有m6A的水平显著降低，而其他检测的修饰（如m5C、Am、Cm、Gm、Um）没有显著变化。这证实了环亮氨酸能够特异性抑制绣球菌中的RNA m6A修饰。
2. 全局m6A甲基化组的变化
通过甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）分析，绘制了环亮氨酸处理下绣球菌的全基因组m6A甲基化图谱。m6A峰主要富集在转录本的起始密码子区和编码区（CDS），其核心结合基序为5’-GGACA-3’，符合已知的DRACH基序特征。对比处理组与对照组，共鉴定出1751个差异甲基化峰（DMPs），其中722个为高甲基化，1029个为低甲基化。这些差异甲基化峰相关的基因（DMGs）在基因本体（GO）分析中显著富集于DNA构象改变、染色体组织和ATP结合等过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，这些基因在酵母细胞周期、甘油磷脂代谢和酵母自噬等通路中富集。
3. 转录组水平的变化
基于MeRIP-seq的input文库数据进行转录组分析。共鉴定出436个差异表达基因（DEGs），其中283个上调，153个下调。这些差异表达基因在有机酸代谢过程、氧化还原酶活性、膜相关功能等方面显著富集。KEGG通路分析表明，这些基因在氨基酸生物合成、代谢通路、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸生物合成等通路中富集。
4. m6A甲基化与基因表达的关联分析
将差异甲基化峰与差异表达基因进行联合分析，共鉴定出67个同时具有差异m6A修饰和差异表达的基因。这些基因被富集到脂质代谢、质膜整合组分、跨膜转运蛋白活性等GO条目，以及缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸生物合成、维生素B6代谢等KEGG通路。研究人员选取了其中两个基因（EVM0007546和 EVM0009161）进行验证。EVM0007546基因呈现m6A低甲基化且mRNA表达下调，而EVM0009161基因（编码凋亡诱导因子1，aif1）呈现m6A低甲基化且mRNA表达上调。通过qRT-PCR和MeRIP-qPCR验证，结果与测序数据一致。
1 and p < 0.05. (c) GO analyses of the common genes. (d) KEGG analyses of the common genes. (e, f) Integrative Genomics Viewer (IGV) plots showing examples of m6A peaks at transcript of EVM0007546 and EVM0009161 genes in S. latifolia. Red reads originate from m6A IP libraries and blue reads originate from input libraries. Height of peak represents normalized numbers of reads. Red boxes indicate the DMP of the transcripts under cycloleucine inducement. (g) qRT-PCR validation of the EVM0007546 and EVM0009161 genes in S. latifolia under cycloleucine inducement. (h) meRIP-qPCR validation of the m6A-methlyation level of EVM0007546 and EVM0009161 genes in the S. latifolia under cycloleucine inducement (n = 3/group). *** means p < 0.001.">
5. 绣球菌中m6A相关基因的全基因组鉴定
通过对绣球菌基因组的全面搜索，共鉴定出4个m6A“书写器”（writers，即甲基转移酶）、3个“阅读器”（readers，即结合蛋白）和6个“擦除器”（erasers，即去甲基化酶）。这些基因分布在不同的染色体上，并含有各自特征性的保守结构域。其中，编码2OG-Fe(II)加氧酶超家族结构域蛋白的基因EVM0008471被鉴定为一个潜在的m6A去甲基化酶。表达分析发现，在环亮氨酸诱导下，EVM0008471基因的表达显著上调。这表明环亮氨酸可能通过上调EVM0008471的表达，从而降低绣球菌中全局的m6A修饰水平。
讨论与结论
本研究首次在食用担子菌中揭示了m6A表观转录组学在菌丝生长调控中的作用。环亮氨酸通过抑制绣球菌的RNA m6A修饰水平，调控了一系列与生长相关的基因表达，从而导致菌丝生长受阻。其潜在机制涉及多个方面：
- 1.
影响有机酸和氨基酸代谢：差异表达基因显著富集于有机酸代谢过程和多种氨基酸（如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）的生物合成通路。这表明环亮氨酸可能通过干扰细胞的蛋白质合成和初级代谢来抑制生长。
- 2.
调控膜功能和转运：多个与质膜整合组分、跨膜转运相关的GO条目被富集，暗示环亮氨酸可能影响菌丝顶端生长所需的膜运输和物质交换过程。
- 3.
涉及细胞凋亡和自噬：关键基因EVM0009161（aif1）的上调，以及自噬相关通路的富集，表明细胞程序性死亡途径可能参与了环亮氨酸介导的生长抑制。
- 4.
关键调控因子EVM0008471**：该基因编码的潜在m6A去甲基化酶表达上调，可能是环亮氨酸导致全局m6A水平下降、进而引发下游转录组重编程的关键中间环节。
总而言之，本研究为理解真菌m6A修饰的生物学功能提供了新的见解，特别是其在食用菌生长调控中的作用。研究成果不仅增进了对真菌表观转录组学的认识，也为通过靶向m6A修饰途径来优化绣球菌等食用菌的工业栽培效率提供了潜在的理论依据和分子靶点。
