PD-1遗传谱系示踪揭示介导PD-1阻断联合化疗疗效的免疫细胞多样性

《OncoImmunology》：PD-1 genetic fate mapping uncovers immune cell diversity mediating the efficacy of combined PD-1 blockade and chemotherapy

本研究通过建立Pdcd1谱系示踪(Pdcd1fm)小鼠模型，追踪了PD-1表达细胞在免疫检查点抑制剂(ICI)联合细胞毒性化疗（环磷酰胺CTX）治疗PD-L1低表达肺癌（Lewis肺癌，LLC）过程中的命运。单细胞分析发现，联合疗法能特异性地扩增并多样化具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的PD-1谱系示踪CD8+T细胞克隆，特别是Tpex1样细胞，从而驱动强效抗肿瘤免疫。该研究为阐明联合疗法的机制和鉴定有效应答的免疫细胞提供了宝贵工具。

　　

文章内容归纳总结

引言

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。尽管免疫检查点抑制剂(ICI)已极大改变了肺癌治疗格局，但对于占多数的PD-L1低表达患者，通常需要采用联合治疗策略。临床前研究表明，ICI与细胞毒性化疗联合可提高抗肿瘤疗效，但其具体机制，特别是对特定免疫细胞克隆的调控作用，尚不明确。一个主要挑战在于PD-1在多种免疫细胞上广泛且瞬时表达，这使得全面分析受ICI调控的PD-1⁺细胞变得复杂。Lewis肺癌(LLC)是一种PD-L1低表达、对PD-1/PD-L1单药阻断反应不佳的小鼠肺癌模型，是研究联合疗法的相关临床前模型。

Pdcd1谱系示踪小鼠揭示淋巴细胞瞬时表达PD-1

为追踪PD-1表达细胞，研究团队构建了Pdcd1谱系示踪(Pdcd1^fm)小鼠。该模型通过在Pdcd1基因编码区末端插入P2A-Cre-ERT2序列，并将其与Rosa26-loxP-STOP-loxP-tdTomato报告小鼠杂交获得。在给予他莫昔芬诱导后，曾表达PD-1的细胞会被永久标记上tdTomato荧光蛋白。

验证实验显示，在脾脏中，tdTomato表达与PD-1表达相关，但大部分被标记的细胞（包括CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、B细胞、γδ T细胞和NK细胞）在标记后第7天下调了PD-1表达，证实了PD-1表达的瞬时性。在胸腺中，tdTomato表达在双阴性(DN)4阶段达到峰值，随后在细胞向单阳性阶段成熟过程中逐渐下降。这表明一部分T细胞在胸腺发育过程中瞬时表达PD-1，随后在外周下调其表达。

肿瘤微环境除NK细胞外维持免疫细胞的PD-1表达

在荷有LLC肿瘤的Pdcd1^fm小鼠中，研究人员比较了脾脏和肿瘤浸润白细胞(TILs)中tdTomato⁺细胞的特征。与脾脏相比，肿瘤中tdTomato⁺的CD8⁺T细胞、调节性T(Treg)细胞和树突状细胞(DCs)比例更高。重要的是，与脾脏中对应细胞普遍下调PD-1不同，肿瘤内的tdTomato⁺淋巴细胞（除NK细胞外）维持了更高的PD-1表达水平。

NK细胞是一个例外，其在肿瘤中发生了部分PD-1下调。功能实验显示，tdTomato⁺PD-1^–的NK细胞比tdTomato⁺PD-1⁺的NK细胞能分泌更高水平的干扰素-γ(IFN-γ)，提示PD-1下调可能有助于NK细胞在肿瘤中维持功能活性。

单细胞分析揭示受环磷酰胺和/或ICI影响的PD-1⁺细胞

为研究联合疗法机制，研究人员用环磷酰胺(CTX)和/或抗PD-1抗体(ICI)治疗荷有LLC肿瘤的Pdcd1^fm小鼠。结果表明，抗PD-1单药疗效有限，CTX单药可显著抑制肿瘤生长，而CTX+ICI联合治疗显示出最佳的肿瘤控制效果。

对肿瘤内tdTomato⁺免疫细胞进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，共鉴定出15个转录组不同的免疫细胞簇。联合治疗组在具有细胞毒性的CD8⁺T细胞簇（簇1）和一个功能失调的Treg细胞簇（簇4）中占比最高。CTX治疗则与tdTomato⁺髓系细胞簇（包括单核细胞性髓系来源抑制细胞mMDSC、粒细胞性MDSC gMDSC和DC）的比例增加相关。

ICI治疗提高tdTomato⁺细胞群中CD8与CD4 T细胞的比例

为进一步分析T细胞，研究人员提取了具有T细胞受体(TCR)信息的细胞进行转录组分析。结果显示，联合治疗组中早期活化的CD8⁺T细胞和终末耗竭的CD8⁺T细胞簇富集。ICI治疗（无论是单药还是与CTX联用）提高了tdTomato⁺T细胞中CD8⁺T细胞与CD4⁺T细胞的比值。

CTX与ICI联合疗法在肿瘤中诱导tdTomato⁺Tpex1样CD8⁺T细胞

流式细胞术分析验证了单细胞测序的结果。ICI治疗显著增加了tdTomato⁺细胞中CD8⁺T细胞的比例。进一步对祖细胞耗竭T(Tpex)细胞亚群（根据标志物SLAMF6和CD69分为Tpex1和Tpex2）的分析显示，ICI单药组中Tpex2样细胞频率较高，而CTX+ICI联合治疗组则优先增加了更静息、具有自我更新能力的Tpex1样细胞的比例。

在髓系细胞中，CTX单药和联合治疗均显著扩增了tdTomato⁺的mMDSC和DC（经鉴定为cDC2亚型）。

CTX与ICI联合疗法促进靶向肿瘤的CTL克隆多样化

功能实验表明，来自联合治疗组肿瘤的CD8⁺T细胞在与LLC细胞共培养时，产生了最高水平的IFN-γ，表明联合疗法能有效增强CTL活化。通过单细胞TCR测序(scTCR-seq)分析TILs中的TCR克隆型，发现多个高丰度克隆型在联合治疗组肿瘤中特异性富集。其中，克隆型Top1、11和15主要出现在CD8⁺T细胞中。

研究人员将Top1和Top15克隆型的TCR序列通过逆转录病毒转导至CD8⁺T细胞中，这些工程化T细胞在与LLC肿瘤细胞共培养时产生了显著更高的IFN-γ，证明这些克隆型能够介导肿瘤特异性的CTL反应。

讨论

本研究利用Pdcd1^fm小鼠系统，全面绘制了受ICI联合或不联合细胞毒性化疗调控的PD-1表达细胞图谱。该系统能高效标记PD-1表达细胞，从而在LLC模型中鉴定出对CTX+ICI联合疗法产生应答的、具有肿瘤杀伤活性的CTL克隆型。研究结果表明，联合疗法通过诱导CTL克隆的多样化，从而产生优于单药治疗的效果。尽管本研究中使用CTX作为化疗药物存在一定局限性，但该谱系示踪系统为深入剖析ICI治疗的免疫机制，特别是在肿瘤特异性抗原未知的情况下鉴定有效的T细胞克隆，提供了一个强大的工具。这一平台对于研究免疫治疗的长期效应和免疫相关不良反应也具有潜在价值。