结直肠癌生物标志物MACC1与IER2的调控交互作用及其对转移性癌症生存的影响

《Biomolecules》：The Regulatory Interplay of the Colorectal Cancer Biomarkers MACC1 and IER2 and Its Impact on Metastatic Cancer Survival Miguel Enrique Alberto Vilchez, Benedikt Kortüm, Paul Sch?pe, Lenka Kyjacova, Fabian Zincke, Marc Osterland, Janice Smith, Wolfgang Walther, Beate Rau and Ulrike Stein + 1 author

本文揭示了结直肠癌（CRC）关键生物标志物MACC1与IER2之间的功能协同关系。研究发现，MACC1可正向调控IER2表达，二者蛋白质存在物理相互作用，且高表达IER2可促进细胞集落形成与增殖。临床数据证实，MACC1与IER2在肿瘤中协同高表达的患者，其总生存期（OS）显著缩短。该研究阐明了MACC1/IER2轴在CRC进展中的关键作用，为预后评估与联合靶向治疗提供了新思路。

　　

结直肠癌生物标志物MACC1与IER2的调控交互作用及其对转移性癌症生存的影响

摘要

在结直肠癌（CRC）中，MACC1与IER2是两个已被确认的功能性生物标志物。通过生物信息学相关性分析，研究人员发现IER2与MACC1的RNA表达水平呈显著正相关。在功能获得与功能缺失实验中，证实MACC1能够正向调控IER2的表达。同时，蛋白质下拉实验提供了MACC1与IER2存在蛋白-蛋白相互作用的证据。在功能层面，MACC1能够增强过表达IER2的HCT116细胞的增殖能力，但对IER2表达被敲低的HCT116细胞则无此效应。临床数据分析显示，MACC1与IER2两者均高表达的患者生存期显著缩短，而两者均低表达的患者则拥有最长的生存期。综上所述，这些发现揭示了结直肠癌生物标志物MACC1与IER2之间的功能交互作用，并进而对结直肠癌患者的生存产生重要影响。

1. 引言

结直肠癌是全球最常见的癌症诊断之一，也是癌症相关发病和死亡的主要原因。转移性CRC更是导致患者生存期急剧缩短的关键因素。利用基于生物标志物组的患者分子谱分析技术来个性化治疗CRC，对于优化疗效和减少毒性具有巨大前景。越来越多的证据表明，许多生物标志物以相互作用的方式影响着预后和治疗效果。理解这些相互作用，为合理、同时靶向相互依赖的通路以增强疗效，以及进行序贯靶向治疗（即当一种靶向治疗失败时，可抑制替代通路）提供了前景。此外，这些知识有助于规避导致耐药的通路串扰，并确定应用靶向治疗的最佳顺序。

在前期工作中，研究团队已确定转移相关结肠癌蛋白-1（MACC1）是转移和肿瘤进展的关键调节因子，也是在包括CRC在内的20多种实体癌中稳健的预后生物标志物。Meta分析证实，MACC1的过表达与实体瘤患者较差的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）相关。在CRC中，I-III期肿瘤较高的MACC1表达与发生异时性转移的风险增加相关，突显了其预后意义。

在其他研究中，研究团队发现即早反应基因家族成员IER2的表达，与结直肠腺癌患者较差的的无转移生存期和总生存期相关。IER2可由p38和JNK等诱导增殖和迁移的信号刺激快速诱导，在多种癌症中强烈上调，并在转移中发挥功能性作用。在分子水平上，IER2通过调节蛋白磷酸酶2（PP2A）全酶，影响HSF1和CDC25A等关键靶点，进而影响细胞增殖和凋亡。此外，IER2还与肝细胞癌（HCC）转移以及黑色素瘤的不良预后相关，后者是通过p53/p21轴促进衰老相关分泌表型（SASP）实现的。这些发现突出了IER2在癌症进展中的多方面作用及其作为治疗靶点的潜力。

本文提供了MACC1与IER2之间协同作用的证据，其中MACC1促进IER2表达，而IER2则促进集落形成和持续的细胞增殖。这种相互作用导致转移性CRC（mCRC）患者的预后显著恶化，因为这两个基因的同时过表达识别出了一个具有最短总生存期（OS）的患者亚群。

2. 材料与方法

2.1. 细胞培养

从美国模式培养物保藏所获取的SW480、SW620、HCT116、RKO和DLD1细胞系，在补充了10%胎牛血清（FBS）的DMEM或RPMI培养基中培养。如先前所述，构建了具有或不具有外源性MACC1表达的SW480细胞系。同样，根据先前的方案，建立了靶向MACC1的短发夹RNA（shRNA）的SW620克隆及其对照。来自海德堡大学的Jonathan Sleeman教授提供了HCT116/IER2和HCT116/EV细胞系。使用CRISPR/Cas9技术和向导RNA，在SW620细胞系中进行IER2的基因敲除，并生成无向导RNA转染的对照细胞系。通过单细胞分选克隆，并由LGC Genomics GmbH公司确认IER2编码区的改变。细胞培养在37°C、5% CO₂条件下，并定期使用试剂盒检测支原体污染。

2.2. RNA提取与RT-qPCR

遵循标准实验室方案进行RT-qPCR定量。使用通用RNA纯化试剂盒提取总RNA。将纯化的RNA（50 ng）在含有随机六聚体、RT缓冲液/dNTP混合物、RNase抑制剂和MuMLV逆转录酶的反应体系中进行逆转录。生成的cDNA使用基因特异性引物组和HotStart DNA Master SYBR Green I试剂盒进行基因特异性qPCR。在LightCycler 480系统上进行扩增，包括95°C初始变性，随后进行40个循环的变性（95°C，5秒）和引物退火/延伸（60°C，45秒）。数据分析使用配套软件完成。计算重复孔的平均值，并将每个基因的表达量标准化为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）或人RNA聚合酶II（RPII）（用作看家基因）的平均量。

2.3. 蛋白提取与蛋白质印迹法

将细胞在6孔板中培养至所需汇合度后，用RIPA缓冲液在冰上裂解30分钟。使用BCA蛋白测定试剂测定蛋白浓度。等量的蛋白质裂解物通过SDS-PAGE分离，并使用半干转印系统转移到PVDF膜上。膜在室温下用5%脱脂牛奶的TBS-T缓冲液封闭1小时。随后，膜在4°C下与针对MACC1、IER2或β-actin的一抗孵育过夜。洗涤后，膜在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1小时。使用ECL底物显影，并在X光胶片上曝光。β-actin表达作为上样对照。所有实验均独立进行至少三次。

2.4. 免疫共沉淀

对于免疫共沉淀（Co-IP）实验，将细胞接种在10厘米细胞培养皿中，孵育24小时形成单层细胞。用PBS洗涤一次后，在冰上IP裂解缓冲液中刮下细胞，裂解30分钟。通过离心获得全细胞裂解物。将裂解物分成等份，向每份裂解物中加入目标抗体，在4°C旋转摇床上孵育过夜。通过添加G-琼脂糖珠并孵育4小时来捕获蛋白-抗体复合物。弃去上清，用IP裂解缓冲液洗涤珠子五次。最后，在补充了DTT的LDS缓冲液中于99°C洗脱蛋白复合物10分钟。离心后，取上清进行蛋白质印迹分析。

2.5. 增殖实验

将细胞以每孔2×10⁴个的密度接种在96孔板中，每个细胞系设技术重复孔。加入相应培养基后，将板置于IncuCyte^?ZOOM系统中。培养箱条件维持在37°C、5% CO₂湿度。系统设置为每2小时捕获一次图像。96小时后终止实验并收集数据点，以便对细胞汇合度进行量化。结果从至少三次独立实验计算得出。

2.6. 生存分析与表达微阵列数据挖掘

使用RT-qPCR测量了60名I、II或III期CRC患者肿瘤样本中MACC1和IER2的mRNA表达。通过基因表达综合数据库（GEO）搜索公开可用的CRC肿瘤微阵列表达数据。获取了目标基因MACC1和IER2的表达数据，并标准化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达数据，随后分析其直接或负相关性。

2.7. 统计分析

使用GraphPad Prism 6版进行统计分析。相关性分析采用Pearson相关系数r。多组与对照的比较采用单因素方差分析（ANOVA）。两组间的比较采用非配对t检验。使用Kaplan-Meier估计量计算生存率。通过受试者工作特征（ROC）分析确定区分低表达和高表达水平的截断值，其中MACC1和IER2的最佳截断值分别定为232.84和6.21，以最大化约登指数。统计学显著性设定为p < 0.05（）、p < 0.01（）和p < 0.001（**）。

3. 结果

3.1. MACC1与IER2转录本和蛋白质的生物信息学相关性分析

为了确定CRC生物标志物之间可能的协同表达，研究团队查询了NCBI的GEO数据库。数据集GDS4718包含来自44名患者的代表不同疾病分期（伴或不伴转移）的均质化CRC肿瘤的表达分析数据。提取了MACC1和IER2以及稳定表达的看家基因GAPDH的表达值。标准化后的值被绘制成图。使用Pearson R相关性分析，IER2/MACC1关联显示出显著的正相关（R²= 0.7544）。

为了初步理解MACC1和IER2表达之间的正相关，研究团队进一步查阅了用于预测蛋白质相互作用和相互作用位点的数据库。在STRING网络中搜索“IER2—homo sapiens”，返回了预测的功能伙伴，如EGR1、BTG2、JunB、FOS和GRB2等。这些关联通过文本挖掘和共表达分析（包括抗诱饵免疫共沉淀或串联亲和纯化实验）进行预测，因此仍需要直接的实验验证。IER2和MACC1的相互作用网络图显示，两种生物标志物的相互作用网络中均存在大量与癌症相关的蛋白质，但最初预测它们在CRC进展中的作用是独立的。

3.2. MACC1在CRC细胞中调控IER2表达

为了进一步理解CRC患者中MACC1和IER2表达之间的相关性，研究团队研究了MACC1对IER2表达的影响。在先前工作中，研究团队将MACC1稳定转染到内源性缺乏MACC1表达的人SW480结肠腺癌细胞中，导致MACC1 mRNA水平相对于空载体（EV）对照显著增加。有趣的是，与EV对照相比，在表达MACC1的细胞中也同时观察到IER2 mRNA表达上调了20倍，这一发现在蛋白质水平得到了证实。另一方面，源自同一患者转移灶的SW620细胞，其内源性MACC1水平升高。将MACC1特异性短发夹RNA（shRNA）引入SW620细胞，导致MACC1和IER2的mRNA表达均显著降低，这在蛋白质水平也得到了确认。

为了进一步证实MACC1正向调节IER2表达的观点，研究使用了携带四环素诱导型MACC1启动子的HCT116细胞。用强力霉素诱导细胞，并在暴露后两个时间点（0和4小时）通过RT-qPCR评估转录水平。同时，使用短发夹MACC1（shMACC1）四环素诱导型构建体在SW620细胞系中进行了功能缺失实验，并增加了2小时的时间点。

强力霉素应用4小时后实现了MACC1的过表达，与抗生素应用前的基线表达相比，mRNA表达增加了2.65倍。同时，IER2的表达与对照相比增加了30%。相反，在MACC1下调模型中，暴露于强力霉素2小时导致MACC1 mRNA表达与对照相比显著降低70%，同时IER2 mRNA表达呈不显著的30%降低趋势。暴露4小时后，MACC1和IER2的mRNA表达分别显著降低了99%和76%。

3.3. IER2促进CRC细胞的集落形成并维持增殖

为了解读MACC1诱导的IER2表达对CRC细胞致瘤特性的可能贡献，研究在HCT116细胞中异位表达了IER2，并进行了集落形成实验。与转染空载体对照的细胞相比，异位表达IER2的细胞中观察到的集落数量显著增加，表明IER2过表达与集落形成能力增强显著相关。与这些结果一致，在使用IER2缺失的SW620细胞进行的功能缺失实验中，与Cas9-EV对照细胞相比，IER2缺失的细胞增殖率显著降低，表明IER2表达是维持持续增殖所必需的。

3.4. IER2与MACC1蛋白质发生物理相互作用

鉴于IER2和MACC1蛋白在促进癌细胞迁移和侵袭行为方面的功能贡献，以及它们互补的相互作用网络，研究团队接下来进行了免疫共沉淀实验，以测试MACC1和IER2是否发生物理相互作用。为此，从SW480/MACC1转染细胞的裂解物中免疫沉淀MACC1，并通过蛋白质印迹法评估免疫沉淀物中IER2的存在。使用抗β-微管蛋白抗体的免疫沉淀作为阴性对照。结果显示，使用MACC1抗体的免疫沉淀物中存在IER2，但在抗β-微管蛋白抗体对照中不存在，这表明MACC1和IER2蛋白之间存在相互作用。该数据为即刻早期转录反应与持续促转移信号传导之间的分子联系提供了首个证据。

3.5. MACC1与IER2的协同表达与CRC患者最差预后相关

基于IER2和MACC1在促进CRC进展和转移中的关键作用，研究团队接下来分别及共同评估了MACC1和IER2表达对患者预后的影响。为此，调查了60名CRC患者样本中这些基因的转录水平，并利用Kaplan-Meier图分析了随时间（月）变化的累积生存率。IER2高表达患者的总生存期显著短于低表达患者。IER2 mRNA高肿瘤表达与约50%的10年生存率相关，而IER2低表达患者的10年生存率约为80%。类似地，MACC1高表达值与这些患者较短的生存期相关。MACC1高肿瘤表达导致约30%的10年OS，而MACC1低表达患者的10年总生存率接近70%。有趣的是，MACC1和IER2两者均高表达的患者累积生存期显著缩短，而两者标志物浓度均低的患者则表现出最长的生存期：IER2和MACC1 mRNA表达水平均高的患者，其5年OS为50%，10年OS为30%。相反，当两个基因表达均低时，5年和10年OS率均超过90%。

4. 讨论

对CRC背后遗传和表观遗传改变的研究为临床医生提供了广泛的预测性分子标志物，其中一些现已用于CRC患者的常规治疗。理解这些生物标志物之间的相互作用正在从根本上重塑对CRC生物学和治疗的理解。基于网络的方法揭示了分子关系如何驱动疾病进展、治疗耐药性和患者结局，而非将生物标志物视为独立实体。这些发展对推进精准医学具有重要意义。例如，当考虑生物标志物相互作用时，预后准确性将得到提高。治疗策略必须考虑生物标志物网络而非单个标志物，并应靶向网络脆弱性而非单一通路。由于耐药机制通常涉及通路串扰，基于对生物标志物相互作用理解的联合方法也将有助于对抗治疗失败。本文报道的CRC生物标志物MACC1和IER2之间的功能相互作用，增进了对CRC生物标志物网络的理解，并有可能提高预后准确性和改进治疗策略。

关于预后，先前已显示MACC1或IER2的表达与CRC患者的不良生存相关。本研究中，确认并扩展了这些发现。重要的是，研究表明MACC1和IER2的同时表达是比单个生物标志物表达更强的预后不良预测因子。这些临床数据支持了MACC1和IER2以互补方式促进CRC进展和转移的观点。它们还表明，评估两种生物标志物的表达应能提供比评估单一生物标志物表达更优的诊断准确性。此外，它们提示同时靶向MACC1和IER2治疗可能比仅靶向其中一种生物标志物更有效。

利用GEO数据库进行的生物信息学分析揭示了MACC1 mRNA表达与IER2 mRNA表达之间存在稳健的正相关。一致地，在功能缺失和功能获得实验中，研究发现MACC1表达上调IER2转录和蛋白表达的证据。已知MACC1通过调节信号通路活性或通过直接结合靶基因（如MET和S100P）的启动子来调节许多靶基因的转录。未来的工作将侧重于研究MACC1刺激IER2表达的确切机制。

IER2被描述为即刻早期基因（IEG）之一，这些基因具有在细胞受到化学和/或物理刺激后数分钟内快速诱导的生物特性。一项在造血干细胞中的研究证明，Fos是增殖应激下IER2表达的直接启动子。在肿瘤组织中，IER2标志着活化的成纤维细胞（即增殖、迁移的癌症相关成纤维细胞—CAF）和癌细胞，如在CRC和黑色素瘤中所显示的。缺氧是复发性脊索瘤CAF中IER2表达的强诱导剂。MACC1是肿瘤缺氧的因果生物标志物，并通过Warburg效应提高癌细胞在缺氧条件下的生存能力：通过将葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）转运到细胞膜，MACC1改善癌细胞的葡萄糖摄取。这与MACC1过表达使癌细胞能够耐受增殖性迁移和侵袭的缺氧过程的发现一致。

MACC1增加IER2的表达可能有助于促进CRC进展，因为研究发现IER2表达刺激CRC细胞的集落形成和持续增殖。IER2被认为是G1-S细胞周期转换的调节因子。最近用于预测细胞周期组件的贝叶斯模型成功识别了CDC25A等已知因子，并强调了IER2参与G1-S转换。与此一致，研究表明IER2与14-3-3蛋白（一种调节蛋白）促进CDC25A的相互作用。这种相互作用发生在CDC25A C端的一个细胞周期蛋白B1/细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）位点内的T507残基处。IER2通过使T507去磷酸化，破坏CDC25A与14-3-3的结合，从而激活CDC25A。CDC25A对细胞增殖至关重要，受到严格调控，其失调可通过促进G1-S转换和G2-M检查点所需的CDK去磷酸化和激活来显著影响细胞周期。因此，由CDC25A功能障碍介导的异常细胞周期调控可能是IER2过表达细胞集落形成能力增强的基础。此外，IER2诱导的下游mTOR效应物S6激酶（S6k）的过度磷酸化，已被证明参与细胞增殖的调控，因此S6k磷酸化的降低也可能有助于解释IER2敲低后观察到的增殖减少。

尽管在机制上本研究显示MACC1表达促进IER2表达，而IER2反过来促进集落形成和细胞增殖，但临床数据表明，IER2和MACC1两者的表达比任一单独生物标志物具有更显著的预后意义。后一观察结果表明IER2和MACC1对不良患者预后具有互补效应。STRING网络分析为此观点提供了一些初步支持。然而，值得注意的是，STRING分析并未标记出已被证明与MACC1或IER2发生物理相互作用的许多蛋白质。例如，MACC1与许多细胞内激酶（最显著的是MEK1）、调节受体运输的网格蛋白介导的内吞蛋白，以及转录调节因子和信号转导蛋白（如SNAI1和YWHAE）发生物理相互作用。MACC1的SH3结构域和富含脯氨酸区域在这些相互作用中起关键作用。IER2与蛋白磷酸酶PP2A、细胞周期调节因子CDC25A、肿瘤抑制蛋白RB和FGF结合蛋白FIB