《Biomolecules》：Resolving Diagnostic Uncertainty in Neurodevelopmental Disorders Using Exome Sequencing Supported by Literature-Based Multi-Omics Evidence
Danijela Krgovic,
Peter Gradisnik,
Andreja Osterc Koprivsek,
Ana Kogovsek,
Nadja Kokalj Vokac and
Spela Stangler Herodez
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本研究通过临床队列分析，阐释了在神经发育障碍（NDDs）的诊断中，尽管全外显子测序（ES）已成为一线工具，但大量意义不明确的变异（VUSs）及不完全外显的遗传变异仍是临床解读的主要挑战。文章创新性地提出，整合来自文献的多组学证据（包括转录组学、蛋白质组学、模型系统等）能够显著增强对罕见和新生变异的致病性解读，为提升NDDs精准诊断的置信度提供了有力支持。
引言：神经发育障碍的遗传异质性与诊断挑战
神经发育障碍（NDDs）是一组具有显著遗传异质性的疾病，其病因复杂。基于三重全外显子测序（Trio-ES）或全基因组测序（GS）的大规模研究已表明，新生变异是重要的致病原因。尽管ES/GS作为一线诊断方法的诊断率可达35-40%，但其结果常产生大量意义不明确的变异和具有不完全外显可能的变异，这为患者和医疗专业人员带来了沉重负担。对测序数据的再分析（整合更新的临床信息和新发表的证据）可将诊断率额外提高达12%，但VUSs的解释依然困难。此外，不完全外显在NDDs中已被认识，不仅限于拷贝数变异，也可能涉及单核苷酸变异。因此，在变异解读框架中纳入不完全外显概念，并对遗传自表型健康父母的变异保持谨慎，变得日益重要。为减少诊断中的VUSs，除数据再分析外，转录组学、蛋白质组学等多组学方法也越来越多地被用于提高NDDs及其他罕见病的诊断率。
本研究描述了一个小型NDDs患者队列，他们通过三重ES识别出可能致病的变异。文章既呈现了罕见的新生和遗传性VUSs、可能致病和致病性变异，也重点阐述了如何利用文献中新兴的多组学证据来支持对新生和罕见变异的解读，从而在特定病例中精炼其分类。
材料与方法：精准的患者入组与严格的变异筛选
研究在2018年至2025年间招募了来自斯洛文尼亚马里博尔大学医学中心的20名NDDs患者及其父母。临床信息通过人类表型本体学术语收集。ES分析采用表型驱动策略，潜在致病性变异依据美国医学遗传学与基因组学学会及其它相关指南进行分类。所有参与者均签署知情同意书。
ES检测采用商业化的捕获试剂盒和Illumina平台进行，平均测序深度为100×。数据分析与注释使用了Franklin生物信息学工具。变异筛选有严格标准：需被分类为VUS、LP或P；在gnomAD v4.1.0人群数据库中的等位基因频率需低于0.00001；需有计算证据支持其有害性；并需进行家系分离分析。一个由实验室遗传学家和临床医生组成的多学科团队最终评估每个变异是否可作为临床表型的合理解释。
结果：临床队列的遗传谱与功能聚类分析
对20名患者（19名完成了三重分析）的研究共鉴定出20个罕见变异，涉及18个NDDs相关基因。其中包括3个致病性、9个可能致病性和8个意义不明确的变异。所有P变异和大多数LP变异为新生。值得注意的是，在一些基因中发现了遗传自表型健康父母的变异，突显了不完全外显的挑战。其中两名患者存在双重分子诊断。这18个基因的功能汇聚于四个主要生物学领域：染色质与转录调控、发育信号通路、突触结构与信号传导、以及代谢/自噬。
意义不明确的变异病例解读
研究详细分析了8例VUSs。例如，患者1携带CDON基因的新生错义变异，其表型与已知的全前脑无裂畸形谱系有部分重叠但证据不足。患者2的PPP3CA基因框内缺失位于调控域，功能影响不明确。患者4遗传了ASH1L基因的错义变异，尽管表型匹配且基因限制性评分高，但已报道的致病性错义变异均为新生，因此分类为VUS。患者5遗传了KMT5B的移码变异，表型匹配，但存在无症状携带者报告，提示不完全外显可能。这些案例普遍存在表型-基因型部分匹配、功能证据不足或遗传模式不典型等特点，中的详细汇总展示了这些VUSs的遗传模式、变异类型、计算预测和临床解释。
遗传性与新生致病/可能致病性变异
研究也报告了12例P/LP变异。患者9-13的LP变异为遗传性，其中患者12的CHD4错义变异遗传自有相似表型的母亲，符合Sifrim–Hitz–Weiss综合征。患者13的VAMP2移码变异与先天性静止性夜盲症共存，构成双重诊断。患者14-20的P/LP变异均为新生，涉及ASH1L、KMT5B、CTNNB1等多个基因，其表型与已知的基因特异性综合征高度一致。这些变异大多为可能导致无义介导的mRNA降解的截短变异，位于关键蛋白结构域，系统展示了其详细信息。
多组学证据提供的生物学语境
为支持变异解读，研究汇总了队列中所有基因的多组学与功能证据。显示，这些基因在动物模型、转录组学、蛋白质组学、染色质研究和细胞实验中均显示出与神经发育相关的关键功能。例如，ASH1L是组蛋白甲基转移酶，其缺失会改变突触基因表达；SYNGAP1调节突触可塑性，其单倍剂量不足会破坏细胞骨架控制；ZNF462则通过染色质重塑保障神经谱系特化。
讨论：整合多组学证据以应对变异解读的复杂性
NDDs的遗传机制多样和表型异质性使得变异解读持续面临挑战。传统的ACMG/AMP标准侧重于变异本身的证据，常低估基因和通路层面的生物学背景。动物模型的局限性也使其难以完全复现人类表型。因此，整合多组学方法对于解析基因型-表型差异和阐明疾病机制变得至关重要。
对意义不明确变异的深入探讨
对8个VUSs病例的讨论揭示了各自的具体挑战。CDON变异仅有部分表型重叠且计算预测不确定。PPP3CA调控域变异的功能后果不明。KIF4A变异缺乏充分的功能证据。ASH1L遗传性错义变异违背了“新生”这一常见致病模式。KMT5B和PTCHD1的遗传变异则凸显了不完全外显和蛋白稳定性受损的可能。TMLHE变异与ASD易感性的关联仍需功能研究证实。ANKRD17的新生错义变异虽表型匹配，但病例数有限。这些案例共同说明，仅凭现有标准往往难以对生物学上合理的变异进行明确分类。
遗传性与新生致病性变异的解读与支持
对于遗传性LP变异，如TANC2、SPTBN1和DLL1的截短变异，其明确的单倍剂量不足机制、强烈的表型一致性以及动物模型证据支持了其致病性。CHD4错义变异则得到特定DNA甲基化表观特征的额外支持。对于新生P/LP变异，其致病性解读则更为直接，新生发生、强烈的表型匹配以及已知的基因疾病关联构成了坚实证据。多组学数据，如CTNNB1相关的下游通路失调、SYNGAP1缺失导致的神经元成熟加速、以及ZNF462在维持神经谱系身份中的作用，为这些变异的致病机制提供了深层见解。
结论
本研究展示了全外显子测序在NDDs诊断中的优势与持续存在的局限。尽管通过临床表型、蛋白结构域背景、计算预测和已发表多组学证据的汇聚分析，可以充满信心地解读P和LP变异，但VUSs案例凸显了在功能数据不足、可变外显率和变异特异性效应方面面临的持续挑战。队列也特别指出了遗传性LP变异的解读难点，即微妙或未被识别的亲本表型及不完全外显可能掩盖真正的基因型-表型关系。
尽管本研究自身未生成多组学数据，但对已发表的转录组学、蛋白质组学、表观基因组学和单细胞研究进行系统回顾，被证明对于理解队列中众多基因的变异效应和精炼机制认知至关重要。未来的进展将依赖于扩展功能性检测、开发患者来源的细胞和类器官模型，以及整合多组学框架以精炼基因型-表型关联。随着这些方法的成熟，它们将提高诊断精确度，支持变异重新分类，并增进我们对NDDs生物学的整体理解。
