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本文推荐一项基于新型纳米材料的前沿病毒研究。研究者利用自组装肽RADA16-I构建了模拟细胞外基质的三维（3D）水凝胶支架，成功建立了可长期维持的单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染模型。该模型突破了传统二维（2D）培养的局限，不仅展现了病毒在三维空间内由外至内的渐进性传播和长达22天的持续复制，还揭示了HSV-1感染诱导的自噬反应在2D与3D培养体系中存在显著差异。这项研究为深入探索组织微环境影响宿主-病毒相互作用及病毒致病机制提供了更接近生理状态的新型研究平台。
1. 引言
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种具有神经嗜性的α疱疹病毒，其线性双链DNA基因组大小约为150 kbp。临床上，HSV-1感染可表现为龈口炎、角结膜炎和脑炎，严重时可导致不可逆的失明、永久性神经系统后遗症甚至死亡。原发性感染后，HSV-1会在感觉神经元（尤其是三叉神经节）内建立终生潜伏状态。在免疫抑制或压力等诱因下，病毒可周期性再激活，导致疾病复发。其神经侵袭性、潜伏和再激活的特性，凸显了需要能够模拟神经微环境并支持长期感染动力学的体外模型。
大多数关于HSV-1机制的研究依赖于原代神经元或永生化细胞系的二维（2D）培养。这些系统极大地增进了我们对病毒进入、复制、潜伏相关通路以及抗病毒药物筛选的理解。然而，2D培养缺乏天然组织的结构复杂性，无法再现三维（3D）微环境的关键特征，包括细胞外基质（ECM）硬度、空间细胞极性、细胞-细胞相互作用和旁分泌信号网络。此外，2D系统在模拟持续或潜伏感染等长期生物过程方面能力有限。近年来，3D培养系统已成为模拟组织复杂性和宿主-病原体相互作用的宝贵平台。例如，基于基质胶的3D葡萄膜黑色素瘤模型已被用于研究HSV-1与肿瘤细胞的相互作用。然而，基质胶作为动物来源的基质，其成分不明确、批次间差异大，且存在病原体污染的潜在风险，这些都限制了其可重复性和标准化。其他合成支架，如基于丙烯酸酯的透明甲基丙烯酸甲酯系统，也被探索用于构建3D成纤维细胞模型，结果显示与2D培养相比，3D中感染细胞的恢复更慢，提示微环境可调节感染反应。尽管如此，复杂的制造程序和易污染性限制了其更广泛的应用。
自组装肽RADA16-I已成为3D细胞培养中一种有前景的支架材料。其由明确的氨基酸序列组成，具有良好的生物相容性、低免疫原性和高度的批次间一致性。在生理条件下，它能自组装成纳米纤维水凝胶网络，含水量超过99%，紧密模拟了天然ECM的结构和渗透特性，便于营养物质和信号分子的扩散。其生物医学应用不断扩展，包括作为纳米凝胶载体保护生物活性肽免受酶降解、作为肿瘤免疫治疗中的药物递送平台，以及在神经科学研究中作为促进轴突再生和神经元生长的支架。本研究团队先前已证明，基于RADA16-I的3D培养系统支持长期腺病毒感染，突出了其在病毒学建模中的潜在用途。
尽管3D感染模型取得了进展，但大多数研究主要集中于模型构建和表型表征，对感染过程中宿主调控通路的研究有限。近期利用人诱导多能干细胞（iPSC）来源的脑类器官进行的研究，为HSV-1诱导的神经炎症和损伤提供了重要见解。例如，整合单细胞转录组学和免疫组织化学分析揭示了HSV-1感染后TNF–NF-κB信号通路的强烈激活。在3D神经血管模型中的研究进一步表明，HSV-1感染期间，胶质细胞中的自噬流受到抑制，提示自噬在病毒神经致病机制中可能发挥作用。自噬（巨自噬）是一个进化上保守的、依赖于溶酶体的过程，负责降解受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和入侵的病原体。在此过程中，细胞质货物被隔离到称为自噬体的双膜囊泡中，随后与溶酶体融合以进行降解和回收。迄今为止，大多数关于HSV-1与自噬相互作用的研究都是在2D细胞培养中进行的，这未能充分反映组织结构对细胞反应的影响。比较分析已证明2D和3D HSV-1感染模型之间的转录谱和细胞病变效应存在显著差异，强调了培养维度是病毒-宿主相互作用的关键决定因素。
基于以上考量，本研究旨在建立一个基于RADA16-I的3D培养系统，以在更接近生理微环境的条件下模拟HSV-1的体外感染。我们进一步比较了HSV-1感染后2D和3D培养体系中的自噬动力学。在2D培养中，自噬表现出双相模式，其特征是早期抑制、短暂激活和随后的抑制。相比之下，3D系统在感染早期表现为相对静止，随后在后期阶段自噬活性显著增强。这些发现表明，细胞结构和微环境背景显著影响HSV-1感染期间自噬的时间调节。需要利用更高分辨率的方法进行进一步的机制研究，以阐明潜在的调控通路。
2. 材料与方法
2.1. 扫描电子显微镜（SEM）表征
自组装肽RADA16-I（Ac-RADARADARADARADA-CONH2，纯度≥98%）采用Fmoc固相法合成。水凝胶样品用戊二醛固定，通过梯度乙醇系列脱水并进行临界点干燥。标本安装在铝桩上，并在成像前使用离子溅射镀膜机溅射涂覆一层薄金属。使用日立S-3400N扫描电子显微镜观察形态。
2.2. 三维（3D）细胞培养
Vero细胞购自中国典型培养物保藏中心。细胞在补充了10%胎牛血清的最低必需培养基（MEM）中，于37°C、5% CO2的加湿培养箱中培养。当细胞达到约90%汇合时，用0.05%胰蛋白酶-EDTA解离并重悬于10%蔗糖溶液中。对于12孔板，将75 μL细胞悬液（3 × 104个细胞）与1%（w/v）RADA16-I水凝胶（75 μL）按1:1（v/v）混合，接种到每个孔中。构建体在37°C、5% CO2下孵育。培养基于0.5小时、2小时和24小时后加入，之后每2天更换一次。对于96孔板，将25 μL细胞悬液（1 × 104个细胞）与1% RADA16-I水凝胶（25 μL）按1:1混合，采用相同程序接种。
2.3. 细胞增殖MTS检测
2.3.1. 3D培养中的增殖
Vero细胞在96孔板的1% RADA16-I水凝胶中培养。在第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30天，每孔加入20 μL MTS试剂。在37°C避光孵育2小时后，使用酶标仪在490 nm处测量吸光度。
2.3.2. HSV-1感染后的增殖
3D培养3天后，用感染复数（MOI）为1的HSV-1感染细胞，并在37°C孵育过夜。在感染后第0-26天（如上所述每2天一次）添加MTS试剂。孵育2小时后测量490 nm处的吸光度。
2.4. 细胞DNA定量检测
使用CyQUANT?细胞增殖检测试剂盒进一步定量细胞增殖。对于基线增殖，在0-30天（每2天）收集凝胶-细胞构建体。对于感染后分析，细胞在3D培养3天后感染（MOI = 1），并在感染后0-26天收集。样品用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次，重悬于50 mM柠檬酸钠/100 mM NaCl缓冲液中，并储存于-80°C。细胞通过三次冻融循环裂解。使用Varioskan Flash微孔板读数仪测量荧光。
2.5. 细胞活力和形态评估
2.5.1. 3D培养中的活力
Vero细胞包封在1% RADA16-I中，并在12孔板中培养。在第12天和18天，使用钙黄绿素-AM（Ca-AM）、碘化丙啶（PI）和DAPI进行活/死染色。第18天时，使用鬼笔环肽染色评估F-肌动蛋白细胞骨架组织。使用荧光显微镜捕获图像。
2.5.2. 感染后的活力
3D培养3天后，用HSV-1（MOI = 1）感染细胞。在感染后第6天和第18天，用Ca-AM、PI和DAPI对培养物进行染色，并在荧光显微镜下观察。
2.6. 3D培养中的HSV-1感染
HSV-1（毒株VR-1789）购自美国模式培养物集存库。将培养了3天的3D Vero培养物用MOI为1的HSV-1感染，并在37°C孵育过夜。感染后，用PBS洗涤孔三次，并补充完全培养基。每天监测感染进程。
2.7. 透射电子显微镜（TEM）
对于TEM分析，2D培养物在感染后16小时收集，而3D培养物在感染后3天收集。样品在4°C下用1%四氧化锇固定3小时，通过梯度乙醇系列脱水，并包埋在Spurr树脂中。切取70 nm的超薄切片，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在80 kV下使用JEOL JEM-1230透射电子显微镜观察。
2.8. 病毒复制的定量PCR（qPCR）
在1% RADA16-I中培养的Vero细胞用HSV-1感染。在感染后0-22天（每2天）收集上清液和包埋在水凝胶中的细胞，并储存在-80°C。使用TIANamp病毒DNA/RNA试剂盒提取病毒DNA。使用SsoAdvanced?通用SYBR? Green Supermix在CFX96实时PCR系统上进行qPCR。引物序列为：正向：5′-ATCGGCGAGTACTGCATACA-3′；反向：5′-GAGCTCCAGATGGGGGCAA-3′。每个20 μL反应体系包含10 μL预混液、各0.4 μM的引物和2 μL模板DNA。循环条件为：95°C 2分钟；然后95°C 5秒、60°C 30秒，共40个循环；随后进行熔解曲线分析（65-95°C）。每次运行都包含阴性和阳性对照。使用CFX Manager软件3.1版生成的标准曲线计算病毒基因组拷贝数。
2.9. 3D扩增病毒的感染性
在感染后3天从3D培养物收集的上清液用于以MOI为1感染2D Vero细胞。在感染后1、2和3天收集细胞和上清液。如上所述提取病毒DNA并通过qPCR定量。
2.10. 蛋白质印迹分析
对于3D培养，在感染后12小时、1天、2天和3天收集凝胶-细胞构建体。对于2D培养，在感染后4、8、12、20、24和28小时收集细胞。总蛋白（每样本25 μg）通过12% SDS-PAGE分离，并转印到Protran?硝酸纤维素膜上。膜在室温下用2%牛血清白蛋白（BSA）封闭2小时，并在4°C下与针对LC3B、p62和GAPDH的一抗孵育过夜。洗涤后，膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗孵育。使用增强化学发光试剂显示条带。GAPDH作为上样对照。使用ImageJ 1.54g量化条带强度。
2.11. 统计分析
使用SPSS 29.0版分析数据。结果以平均值±标准差表示。使用独立样本t检验评估两个独立组之间的差异。所有实验均重复三次或以上。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
3. 结果
3.1. RADA16-I的支架表征
扫描电子显微镜（SEM）对纳米自组装肽RADA16-I的分析显示，其在含离子溶液中具有自组装成纳米纤维的能力，呈现出网状结构。这些纳米纤维交织形成多孔网络，其孔结构有利于空气和营养物质的自由扩散，类似于天然细胞外基质（ECM）的多孔性。此外，包封并缠结在纳米纤维网中的细胞表现出3D生长模式。
3.2. 细胞在3D培养中的生长
2D与3D培养的生长差异：在2D培养中，Vero细胞呈纺锤状形态并牢固粘附于基底。到第4天，延迟传代导致过度增殖，耗尽营养物质和可用表面积，从而导致接触诱导的挤压、进行性变形，并最终变圆和脱落。相反，在3D培养中，Vero细胞最初以单个实体存在，随后聚集形成多细胞球体，这在第2天变得明显。随着培养时间延长，这些细胞簇的体积持续增加，其表面特征发生显著变化：最初光滑的表面逐渐变得粗糙，出现明显的突起。此外，在3D培养中观察到Vero细胞的两种形态：大多数形成多细胞球体，而少数呈现分枝形态。这个动态过程不仅显示了Vero细胞在3D培养中的独特生长，也暗示了它们独特的形态转变。
为了进一步评估Vero细胞在RADA16-I 3D培养中的活力和增殖，进行了MTS检测和DNA定量。结果显示，随着培养时间延长，细胞活力和增殖均逐渐增加，活力在第12天达到峰值。值得注意的是，强大的活力可持续长达30天，这表明该模型可能适合后续的长期感染实验，并可用于研究持续感染、潜伏、整合和神经退行性变。此外，钙黄绿素-AM（Ca-AM）染色在第12天显示出强烈的绿色荧光，表明细胞活力高，红色荧光极少。到第18天，观察到红色荧光增加，这可能是由于细胞簇内部区域营养耗尽导致的局部细胞死亡所致。
3.3. HSV-1感染的Vero细胞在RADA16-I 3D培养中的增殖活性
利用已建立的3D细胞模型，实验证实了使用RADA16-I 3D模型进行长期细胞培养的可行性。此外，用HSV-1（MOI = 1）感染该模型，以研究其在3D环境中的病毒传播能力。在2D培养中，HSV-1感染在三天内引起细胞显著的形态学改变。感染后第1天，少数细胞从纺锤形转变为圆形，并伴随细胞内空泡的初步形成。到感染后第2天，大多数细胞变为圆形，周围有明显的细胞碎片。细胞间隙扩大，并观察到大量空泡化、网状的细胞。到感染后第3天，所有细胞均呈圆形，大部分从基底脱落并漂浮在培养基中。培养环境中存在广泛的细胞碎片，表明有明显的细胞溶解效应。相比之下，3D培养表现出与2D培养不同的病理表现。在感染后第3天，细胞簇表面已表现出明显的不规则，提示细胞内部发生早期结构变化。到感染后第6天，细胞簇开始崩解，出现分散的单个细胞和细胞碎片。这表明病理变化起始于细胞簇表面，并逐渐向内传播，随着感染时间延长而加剧，这与先前的报道一致。在感染后第12至18天，细胞簇继续崩解，单个细胞和细胞碎片的数量显著增加。这种感染的动态进展突显了HSV-1对3D细胞聚集体结构组织的深远影响，在我们的模型系统中可以直观地观察到。
感染HSV-1后细胞的活力和增殖得到进一步检测。在RADA16-I 3D培养中，收集不同时间点的样品，通过DNA定量、Ca-AM染色和MTS检测进行分析。与未感染的对照组相比，感染后第2天起，细胞活性和增殖逐渐下降，到感染后第30天几乎观察不到细胞活性。此外，通过Ca-AM染色观察感染后第6天和第18天的3D培养物发现，虽然细胞在感染后第6天仍表现出一定的活力，但到感染后第18天细胞活力已显著下降。我们的观察表明，在基于RADA16-I的3D培养中成功实现了HSV-1感染。
3.4. HSV-1在RADA16-I 3D培养中的复制
上述3D模型显示了HSV-1（MOI = 1）感染后的细胞活力和表型改变。利用透射电子显微镜进一步研究感染细胞内的病毒颗粒，以揭示超微结构变化。值得注意的是，线粒体和内质网明显肿胀，细胞核破裂，细胞质中观察到大量空泡。此外，在细胞内发现了病毒颗粒和自噬相关囊泡。在2D和3D培养中均观察到病毒和自噬溶酶体/自噬体的存在。通过绝对定量PCR（qPCR）进一步分析HSV-1在RADA16-I 3D培养中的复制情况，结果显示病毒载量在感染后第4天达到峰值（6.03 × 105拷贝/mL），随后逐渐下降，但仍可持续复制长达22天。为了消除水凝胶中病毒DNA对实验结果的潜在影响，对无细胞水凝胶进行了HSV-1感染分析，结果显示在水凝胶或上清液中均未检测到病毒DNA。此外，qPCR结果表明，在3D培养中扩增的病毒仍具有感染性，其复制趋势与2D培养一致。这些结果共同支持基于RADA16-I的3D模型支持活跃的HSV-1复制并产生具有感染性的病毒后代。
3.5. HSV-1感染的Vero细胞自噬在2D和3D模型中存在差异
在我们的3D模型中，HSV-1感染后的形态学改变提示可能存在细胞内应激和自噬相关通路的参与。为了进一步表征细胞反应，我们继续分析两种培养系统中关键自噬相关标志物的表达和处理。在2D和3D培养条件下，在不同时间点收集感染了HSV-1（MOI = 1）的Vero细胞样品，并使用蛋白质印迹分析检测了自噬相关蛋白P62和LC3B-II/LC3B-I的相对丰度与感染后HSV-1表达水平的关系。
在2D培养中，Vero细胞感染HSV-1后，从感染后4小时到20小时，P62蛋白水平增加，而LC3B-II水平仅在感染后8小时短暂升高，随后下降。总体而言，HSV-1感染在此阶段似乎抑制了细胞自噬过程。然而，感染后24小时后，P62和LC3B-II水平均下降，这可能提示自噬体加速进入溶酶体进行降解，从而促进自噬流的完成。相反，感染后28小时后，P62和LC3B-II水平均显著上升，表明自噬体的降解过程受阻，进而抑制了自噬流的正常进行。在我们的实验条件下，2D单层细胞对HSV-1感染的自噬反应似乎以时间相关的方式被调控。
在3D培养中，HSV-1感染后细胞自噬的变化表现出明显不同的特征。在感染后12小时和1天，自噬相关蛋白P62和LC3B-II的水平基本保持不变。鉴于此，我们推断自噬未被显著激活。然而，在感染后第2天和第3天，P62水平明显下降，而LC3B-II水平显著上升。这种标志物变化的模式使我们推测HSV-1感染可能同时促进了自噬体的生物发生及其随后的溶酶体降解，可能上调了整体自噬流。这一假设需要进一步的实验验证。
