《Microorganisms》：Endocytosis Mediated by Candida albicans END3 Is Required for Its In Vivo Virulence as an Opportunistic Fungal Pathogen
Miranda Yu,
Cameron Gilmore,
Elena Dos Santos,
Susan Eszterhas and
Samuel A. Lee
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本研究聚焦机会性真菌病原体白色念珠菌，通过小鼠全身性感染模型，揭示了其关键内吞基因END3是维持体内毒力所必需的。end3缺失株在小鼠中完全失去致病力，而野生型和回补株则高度致死，明确了内吞途径是白色念珠菌感染致病的关键环节，为抗真菌治疗提供了新靶点。
白色念珠菌内吞关键蛋白END3介导的胞吞作用是其在体内致病所必需的
白色念珠菌是一种常见的医院获得性血流感染病因，也是导管相关感染和侵袭性疾病的主要原因。其分泌途径通过分泌毒力相关蛋白、促进丝状化过程中的极化分泌以及支持生物膜形成来发挥毒力作用，而生物膜形成进而促进血管内感染和播散。然而，关于白色念珠菌中运输和分泌的分子机制及其在毒力相关过程和发病机制中的作用，目前理解尚不完全。
先前的研究工作表明，由VPS4、VPS4和PEP12介导的前液泡分泌，对于Saps（分泌性天冬氨酸蛋白酶）和脂肪酶的分泌，以及丝状化和生物膜形成是必需的。前液泡分泌在体外和体内感染模型中都被证明是毒力所必需的，特别是VPS4和PEP12基因在小鼠尾静脉感染模型中被证明是体内毒力所必需的。随后的研究发现，晚期分泌在白色念珠菌的极化分泌和丝状化中起着关键作用。有趣的是，许多这些顺行分泌途径似乎也参与了逆行或内吞途径。然而，尽管内吞作用作为一个基本的细胞过程非常重要，但在白色念珠菌中的研究仍然有限。
对早期内吞相关蛋白的研究发现，EDE1基因在白色念珠菌中是非必需的，其缺失株表现出正常的生长和丝状化。PAL1基因的缺失则导致丝状化和生物膜形成缺陷，在诱导条件下形成假菌丝。中间层蛋白编码基因SLA2对丝状生长有显著贡献，其缺失株在液相内吞和极化分泌方面存在缺陷，铁摄取受损，并且由于形态发生检查点激酶Swe1p介导的细胞周期进程延迟，表现出生长速率降低并形成增大的球形母细胞。ENT2编码的中间层蛋白缺失，则导致内吞、丝状化、生物膜形成和体外组织侵袭能力缺陷。
关键晚期内吞基因SLA1也得到了研究。sla1突变株在菌丝诱导条件下丝状化发生改变，产生更短的菌丝，皮质肌动蛋白斑数量减少且不再集中在菌丝顶端。尽管在荧光黄摄取方面缺陷最小，但在FM4-64内化至液泡和受体介导的内吞方面存在显著缺陷。sla1缺失株在小鼠感染模型中的致病力显著减弱，定植也显著减少。内吞基因PAN1在白色念珠菌中似乎是必需基因，其条件突变株在抑制条件下会形成厚而肿胀的细胞，伴有异常的丝状化和FM4-64内吞失败。白色念珠菌的LAS17同源基因WAL1也被研究，其缺失株在内吞、液泡形态和菌丝发育方面存在缺陷，虽然能够进行极化形态发生，但大多数突变株形成假菌丝而非真性菌丝。
最近的研究聚焦于内吞基因END3，它编码一种关键的晚期内吞蛋白，被认为在Sla1募集以及Pan1/End3/Sla1复合物形成中起重要作用。研究发现，白色念珠菌end3缺失株表现出异常的肌动蛋白斑形成、丝状生长、生物膜形成、细胞壁完整性以及细胞外蛋白酶分泌。在体外阴道上皮细胞感染模型中，END3被证明是组织侵袭所必需的，从而揭示了内吞作用与关键毒力相关过程之间的明确联系。为了进一步明确内吞途径在发病机制中的作用，本研究旨在确定内吞基因END3在小鼠播散性念珠菌病尾静脉模型中对毒力和小鼠存活的贡献。
材料与方法
研究所用的end3突变株和回补株已在前期工作中构建和表征。亲本白色念珠菌菌株AHY490来自A. Hernday，而回补株是通过将END3等位基因同源重组到end3缺失株中建立的。这些菌株在30°C的YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）或基本葡萄糖培养基中生长。
所有动物实验均根据机构指南进行，并获得批准。BALB/c小鼠被饲养在无菌啮齿动物微隔离通风笼中。小鼠通过尾静脉注射感染。将处于对数生长中期的酵母相细胞（亲本株AHY490、end3缺失株CREnd3KO和END3回补株CREnd3KI）收获、洗涤、计数并重悬于无菌0.9% NaCl中。每组最多10只BALB/c小鼠经静脉注射0.2 mL细胞悬液，剂量为每只动物1.0×106个细胞，并评估28天内的生存情况。通过比例功效分析确定每组所需样本量为10只。为考虑尾静脉注射失败的可能，初始每组使用了12只小鼠。通过既定的视觉和触觉标准（如回血观察、静脉变白、无阻力、无皮下疱形成）确认静脉接种成功。任何未成功接种的小鼠均被排除在研究之外。
生存曲线使用Kaplan-Meier法绘制，并通过Mantel-Cox检验进行分析。小鼠的初始体重使用Student's t检验进行分析。
结果：END3缺失株在小鼠感染模型中毒力减弱
首先，在一项初步实验中评估了end3缺失株与野生型对照株相比，在小鼠尾静脉播散性念珠菌病模型中的感染能力，比较了约12周龄的雄性和雌性小鼠。感染野生型菌株导致显著的死亡率，7只雌性小鼠中有6只在21天内死亡，8只雄性小鼠中有5只未存活。相比之下，所有感染end3缺失株的小鼠均存活。这项初步实验未测试回补株。
基于这些初步结果，进行了另一项单独实验，仅使用约10周龄的雌性小鼠，比较end3突变株、野生型（亲本）和END3回补株。感染野生型菌株的雌性小鼠易于感染，9只中有7只在28天内死亡。感染end3突变株的10只小鼠组再次显示零死亡率。感染回补株导致10只小鼠中有8只死亡。野生型菌株和回补株之间的生存率微小差异无统计学意义。所有四只未处理的对照小鼠均存活。
此外，在事后分析中，合并了两项实验中所有感染野生型菌株的雌性小鼠的数据，并与第一项实验中感染野生型菌株的雄性小鼠队列进行比较。生存结果无显著差异，这一发现支持了在主要毒力分析实验中使用单一性别小鼠的合理性。在所有情况下，end3缺失株与野生型和回补株之间的生存差异在临床和统计学上均显著，因为所有感染end3突变株的小鼠均未死亡。观察到两项实验中所有感染CREnd3KO的雌性小鼠组以及在初步实验中所有感染CREnd3KO的雄性小鼠均完全存活。这些发现表明，内吞基因END3在尾静脉播散性念珠菌病模型中对于野生型毒力是必需的。
讨论
先前的研究表明，由液泡蛋白分选基因VPS4介导的白色念珠菌前液泡分泌途径在体外是分泌细胞外蛋白酶Sap2和Saps4-6所必需的，并且缺乏VPS4的突变株在小鼠尾静脉播散感染模型中的毒力显著降低。然而有趣的是，发现白色念珠菌VPS4在小鼠阴道念珠菌病模型中对毒力是非必需的，这揭示了前液泡分泌途径在毒力中的作用因感染组织而异。研究还证明，编码参与前液泡运输的t-SNARE的PEP12基因，对于体外正常的生物膜完整性以及体内小鼠尾静脉模型中的毒力也是必需的。
由于内吞途径与前液泡和液泡运输途径存在交集，随后对白色念珠菌中毒力相关表型中内吞作用的作用进行了分析。研究聚焦于关键的早期内吞基因ENT2和END3。ENT2编码一种在早期内吞中参与网格蛋白结合的epsin样蛋白。在白色念珠菌中，证实ent2缺失株在内吞方面存在缺陷：无法形成正常的菌丝和生物膜，并且无法在体外侵袭阴道角质形成细胞。随后的研究证实，在存在多西环素的情况下，tetO调控的ent2缺失株在系统性念珠菌病小鼠模型中是无毒力的。本研究进一步证明了END3介导的早期内吞在毒力中的关键作用，使用了类似的小鼠播散性念珠菌病模型。
在初步研究中，首先试图确定雌雄小鼠的生存率是否存在差异。发现生存率无统计学显著差异，从而确保在该模型中，白色念珠菌播散性感染的生存率不存在主要的生物学差异。值得注意的是，同龄雄性小鼠比雌性小鼠体型更大，这可能是本实验中雄性小鼠中位生存期更长的原因。此外，在一项临床文献的大型荟萃分析中，未将性别确定为危重患者发生侵袭性念珠菌病的风险因素。综合这些发现，认为在毒力研究中使用单一性别小鼠是可以接受的，并且没有必要分别使用雄性和雌性小鼠进行此类实验，特别是考虑到需要基于伦理考量限制实验中使用的总小鼠数量。
研究发现，在所有感染end3 KO的小鼠组中，包括两组感染KO的雌性小鼠，均一致地完全无死亡，而大多数感染WT和KI的小鼠未能存活。综合来看，本研究及先前的研究表明白色念珠菌的早期内吞在关键毒力相关过程（包括丝状化和生物膜形成）中发挥着核心作用。为了更好理解这种常见且危险的机会性病原体如何导致发病和死亡，有必要对白色念珠菌发病机制中内吞作用的作用进行更多的分子研究。
