《Microorganisms》：DNA-Based Bacterial Community Profiles in Air-Dried Historical Soil Archives Are More Representative than Those from Rewetted Soils
Peng Lu,
Bingjie Ji,
Yuan Yan,
Shulan Zhang and
Xueyun Yang
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本综述（研究论文）评估了在长期钙质黄土实验中，风干存档土壤与复湿土壤用于DNA (Deoxyribonucleic Acid) 微生物（细菌）群落结构研究的可行性。通过对比不同存档年限（1、8、18、28年）的风干、复湿与新鲜土壤的细菌群落组成与结构，研究发现，短期（≤8年）风干土壤的群落结构能有效保存，与新鲜土壤高度相似，而同等条件下的复湿土壤群落结构变化更大，表明风干存档土壤是研究土壤微生物长期动态更可靠的历史档案。
1. 引言
微生物是评估土壤质量与健康的关键指标，对维持生态系统功能至关重要。土壤微生物的丰度、多样性和基于DNA的群落结构对环境条件（如水分）高度敏感。虽然新鲜土壤样品是评估微生物群落状态的首选，但在长期监测中，分析方法不断演进，且大量新鲜土壤的长期保存存在困难。因此，全球长期田间实验的大多数存档土壤采用风干方式保存。这些风干的存档土壤为追溯数十年甚至百年尺度的微生物群落动态提供了宝贵资源。然而，风干过程和长期储存可能显著影响微生物存活，导致活性与遗传信息损失。已有研究探讨了使用存档风干土壤的可行性，但也有观点认为复湿土壤可能部分恢复微生物活性，从而获得更可靠的测量结果。为了评估有机质在黄土高原长期储存中对微生物DNA的潜在保护作用，并判断风干历史土壤档案能否可靠地用于描述数十年尺度的微生物时间动态，本研究在黄土高原的黄土性土壤上开展了一项长期施肥试验，比较了新鲜土壤、不同保存年限（1、8、18、28年）的风干存档土壤及其复湿对应土壤的基于DNA的细菌群落组成和结构。
2. 材料与方法
2.1. 研究地点描述
长期田间试验始于1990年10月，地点位于中国国家黄土土壤肥力和肥料效益监测基地，实行冬小麦-夏玉米一年两熟制。该地区年均温约13.0°C，年均降水量550毫米。供试土壤为黄土母质发育的粉粘壤土，被世界土壤资源参比基础（WRB）分类为Anthrosol。试验开始时，耕层土壤有机碳、全氮、Olsen磷、速效钾含量和pH值分别为7.44 g kg-1、0.93 g kg-1、9.57 mg kg-1、191 mg kg-1和8.62。本研究选用两个施肥处理：仅施氮钾肥（NK）和氮磷钾平衡施肥（NPK）。
2.2. 样品采集
新鲜土壤样品采集于2018年，而存档的风干土壤样品分别在2017年、2010年、2000年和1990年采集，保存年限分别为1、8、18和28年。所有样品均在六月冬小麦收获后采集。新鲜土壤样品在-80°C下保存。存档的土壤样品在室温下自然风干后，在环境条件下储存在塑料容器中。复湿处理是将50克风干土壤调整至田间持水量的60%，在28°C黑暗条件下培养14天获得。
2.3. DNA提取、PCR扩增和测序
使用DNeasy PowerSoil Kit从0.5克土壤中提取DNA。使用引物338F和806R对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增。扩增产物纯化后，在上海派森诺生物科技股份有限公司的Illumina MiSeq平台（MiSeq Reagent Kit v3）上进行双端测序。使用QIIME (v1.8.0)处理测序数据，在97%相似性水平下聚类为OTUs，并使用Greengenes数据库进行物种注释。
2.4. 土壤微生物群落相似性
使用R语言的vegan包计算Bray-Curtis相异度，并进一步转化为Bray-Curtis相似度，用于比较存档风干和复湿土壤与新鲜土壤之间微生物群落组成的相似性。
2.5. 统计分析
使用IBM SPSS Statistics 21进行统计分析。由于试验设计存在伪重复，未对施肥处理间进行正式的ANOVA推断比较。Bray-Curtis相异度计算、Spearman相关性分析和箱线图可视化在R中完成。
3. 结果
3.1. 不同储存年限风干与复湿土壤的DNA细菌群落组成
与新鲜土壤相比，无论是NK还是NPK处理，存档风干土壤及其复湿土壤的DNA细菌群落组成的相似性均随储存年限增加呈下降的二次曲线关系。风干土壤的相似性下降幅度小于复湿土壤。具体而言，与新鲜土壤相比，保存1年和8年的风干土壤的群落组成相似性分别平均下降了26%和25%，而保存18年和28年的风干土壤相似性下降幅度更大（31%和36%）。复湿土壤的相似性下降则更为显著，随储存年限增加（1、8、18、28年）分别下降了24%、32%、41%和58%。两种施肥处理间未观察到细菌群落组成相似性的明显差异。
3.2. 门水平上新鲜、存档与复湿土壤中细菌的相对丰度
在所有处理和储存年限中，风干和复湿土壤中检测到的十个优势菌门与新鲜土壤相同。其中六个菌门在复湿土壤和风干土壤中表现出相似的相对丰度时间趋势：放线菌门相对丰度随储存时间增加而升高，而变形菌门、Rokubacteria、浮霉菌门、拟杆菌门和Latescibacteria则呈现下降趋势。复湿过程显著改变了其余四个优势菌门的趋势：酸杆菌门和芽单胞菌门在风干土壤中相对丰度随储存时间增加，但在复湿后下降；绿弯菌门和厚壁菌门在风干土壤中相对丰度稳定，但复湿后，前者显著下降，后者急剧增加。在所有储存年限中，复湿土壤中放线菌门和厚壁菌门的平均相对丰度似乎高于对应的风干土壤。
3.3. 风干土壤及其复湿土壤的DNA群落结构
非度量多维尺度分析（NMDS）和Spearman相关性分析表明，保存1年和8年的风干土壤以及保存1年后复湿的土壤的DNA群落结构与新鲜土壤最为接近。而保存18年和28年的风干土壤以及保存8年或更长时间后复湿的土壤，其DNA群落结构与新鲜土壤有显著差异。
4. 讨论
4.1. 风干与复湿土壤中DNA细菌群落谱的保存
研究结果表明，在短期储存（≤8年）后，风干或复湿土壤与新鲜土壤在基于DNA的细菌群落组成和结构上无明显差异，表明此期间微生物信息损失最小。随着储存时间延长，风干和复湿土壤与新鲜土壤的相似性均呈二次曲线下降，但复湿土壤的下降更为明显。空气干燥过程中的快速水分耗竭有助于防止DNA降解，且部分细菌可通过形成孢子/孢囊或吸附在土壤颗粒上来耐受干燥。然而，细胞裂解、脱氧核糖核酸酶活性、光解和氧化过程仍导致DNA的逐渐损失。复湿过程引入了额外的选择性。不同细菌的耐旱性不同，复苏的类群可能在再水化后占据主导，从而抑制其他类群。微生物对水分的响应速度也不同，14天的培养时间可能不足以让响应较慢的类群完全恢复。此外，16S rRNA测序同时捕获了活菌、死菌和胞外DNA的信息；风干保存了历史的群落“指纹”，而复湿则选择性放大了耐旱/复苏的类群。这些因素共同解释了长期储存中风干土壤比复湿土壤能更好地保存历史群落信息。
4.2. 与施肥制度相关的探索性观察
在该特定长期实验中，平均而言，经NPK处理的土壤（无论是风干还是复湿）的DNA细菌群落组成与新鲜土壤的相似性似乎比NK处理下降得稍多。这种差异可能与土壤有机质或其他养分管理因素有关，但由于试验的伪重复设计和缺乏区组重复，这种与施肥管理相关的探索性关联仅是特定于此实验系统的模式，无法推广。
4.3. 优势细菌门相对丰度的变化
本研究中，在NK和NPK处理下，新鲜、风干和复湿土壤中的优势细菌门基本保持不变，表明这些细菌类群在不同土壤类型和储存条件下具有高度弹性。总体而言，与风干土壤相比，复湿土壤的DNA群落结构与新鲜土壤差异更大，这主要是由于优势细菌门相对丰度的显著变化所致。例如，放线菌门和厚壁菌门在风干土壤中随储存时间有中度增加，但在复湿土壤中急剧上升。相反，酸杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门和变形菌门的相对丰度在复湿后普遍下降，无论它们在风干土壤中的趋势如何。这种模式可用这些优势类群的固有特性解释。厚壁菌门是典型的产孢细菌，在干旱胁迫下快速形成孢子，复湿促进孢子萌发和生长。放线菌门则具有较强的抗旱性和产孢能力。而酸杆菌门等生长缓慢的类群可能在短期复湿中难以恢复；芽单胞菌门适应干旱环境，在湿润条件下适应性差；变形菌门和绿弯菌门的抗逆性有限。这些门水平的差异变化进一步表明，风干存档土壤比复湿土壤更好地保存了基于DNA的历史群落谱。
5. 结论
本研究对钙质黄土长期实验中存档的风干和复湿土壤的DNA细菌群落谱进行了探索性评估。复湿是一个具有选择性的培养过程，可能掩盖历史群落信号。在实验设计和分析方法的限制范围内，长期保存的风干土壤（特别是保存时间≤8年的样本）可作为追溯性微生物研究的宝贵资源，并且比其复湿对应样本能更好地保存基于DNA的细菌群落历史特征。风干和复湿都会导致随储存时间增加的信息损失，但短期存档土壤（≤8年）仍与新鲜土壤保持高度相似性。
