《Microorganisms》：Effect of a Combination of Prebiotic Supplements Based on Fucus and Kelp on the Gut Microbiome of Mice with Induced Inflammation
Anatoly A. Khitrov,
Inna Yu. Burakova,
Yuliya D. Smirnova,
Svetlana V. Pogorelova,
Egor A. Chirkin,
Polina D. Morozova,
Daniil A. Garmonov,
Elena V. Ozhimkova,
Mikhail Yu. Syromyatnikov and
Olga S. Korneeva
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本研究通过DNBSEQ-G50测序和组学分析，系统评估了酶解/未酶解的墨角藻与海带复合益生元对脂多糖诱导炎症小鼠的肠道菌群、代谢通路（如GLUCONEO-PWY、GLYCOLYSIS等）及组织形态的影响，证实其可通过调节特定菌种（如Akkermansia muciniphila、Anaerostipes rhamnosivorans等）丰度、增强葡萄糖分解途径，有效恢复肠道微生物组成与黏膜形态，为藻类源益生元在炎症性肠病等领域的应用提供实验依据。
引言
肠道菌群失衡可导致多种炎症性疾病发生。藻类来源的益生元是维护肠道健康的潜在药物。本研究旨在对补充与未补充益生元的Mus musculus粪便菌群进行比较分析，探究酶法处理的Laminaria digitata和Fucus vesiculosus海藻对脂多糖诱导炎症小鼠肠道微生物组的影响。
材料与方法
研究对象
研究使用从俄罗斯莫斯科州Stolbovaya繁育场获得的C57BL/6品系雄性Mus musculus小鼠。共36只雄性小鼠，分为4组：对照组、脂多糖注射组、补充基于酶法处理的墨角藻与海带的凝胶状益生元并注射脂多糖组、补充基于未水解墨角藻与海带的粉末状益生元并注射脂多糖组。实验包括为期三周的益生元给药和为期一周的脂多糖注射疗程。海藻样品采集自白海，运输和储存于4±2°C。
益生元制备
益生元1制备：海藻清洗、冻干、研磨后，选取50-100μm粒径组分。在50°C、pH 5.0的0.1M柠檬酸盐缓冲液中悬浮，加入复合酶制剂“Ceremix Plus MG”和“Celluclast 1.5 L”，在50°C下水解24小时，后加热至90°C终止反应。益生元2制备：海藻经清洗、冻干、研磨后，直接以50:50比例混合墨角藻与海带粉末。脂多糖使用“Pyrogenal”，与生理盐水1:1混合后腹腔注射。益生元分别以凝胶和粉末形式与蒸馏水混合后添加至饲料。
组织学研究
依据既往方案进行。观察肠道绒毛、杯状细胞、隐窝及黏膜层结构。
DNBSEQ-G50平台测序文库构建
使用宏基因组鸟枪法测序。从粪便样品中提取总DNA，经片段化、加条形码、PCR、环化等步骤，形成DNB后在DNBSEQ-G50平台上进行测序。
生物信息学与统计分析
使用FastQC评估原始读段质量，fastp过滤低质量序列，Bowtie2排除人鼠基因组污染。使用MetaPhlAn4进行物种分类分析，HUMAnN3.0进行代谢通路功能分析。在R环境中进行统计分析，α多样性使用香农指数，β多样性使用Bray-Curtis相异度，差异丰度分析使用MaAsLin2包。p≤0.05为有统计学意义。
结果
组织学
对照组肠道结构正常。脂多糖组肠道黏膜出现多发性破坏性改变，绒毛结构完整性受损，存在细胞浸润和结缔组织增生区域，表明发生炎症过程。益生元1组肠道形态结构整体未变，但存在少量细胞浸润区域。益生元2组肠道组织结构最接近对照组，且肠道黏膜绒毛最高、杯状细胞数量最多，这改善了肠道功能状态。
组织学研究还显示，益生元2组表现出最高的绒毛高度和隐窝深度，暗示该组合对肠道形态结构有刺激作用。脂多糖组绒毛宽度最小，表明肠道黏膜结构组织受损。相关性分析显示绒毛高度与隐窝深度呈中度正相关，绒毛宽度与高度呈弱相关。
DNBSEQ-G50平台测序结果
分析鉴定出8个门、17个纲、25个目、34个科、60个属、115个种细菌。
比较分析确定了39个最常见物种。α多样性分析未发现统计学显著差异。全局β多样性分析显示组间对微生物群落结构的影响不显著，但成对比较显示脂多糖组与益生元1组间存在显著差异。
差异丰度分析显示，在脂多糖组中，与对照组相比，以下物种数量增加：Ligilactobacillus murinus、Alistipes communis、Alistipes senegalensis、Alistipes indistinctus、Alistipes dispar、Alistipes megaguti、Bacteroides thetaiotaomicron、Alistipes finegoldii、Duncaniella dubosii、Bacteroides uniformis、Bacteroides nordii、Alkaliflexus sp. Ai-910、Wansuia hejianensis。
在益生元1组中，与脂多糖组相比，以下物种数量增加：Akkermansia muciniphila、Butyricimonas virosa、Blautia sp. NBRC 113351、Coprococcus sp. ART55/1、Longicatena caecimuris、Anaerostipes rhamnosivorans。相反，以下物种在脂多糖组中丰度显著更高：Duncaniella dubosii、Ligilactobacillus murinus、Alkaliflexus sp. Ai-910、Muribaculum intestinale、Sodaliphilus pleomorphus、Phocaeicola vulgatus、Parabacteroides distasonis。
在益生元2组中，与脂多糖组相比，以下物种显著占优势：Butyricimonas virosa、Vescimonas coprocola、Flavonifractor plautii、Anaerostipes rhamnosivorans、Dysosmobacter welbionis。相反，脂多糖组中Ligilactobacillus murinus和Alkaliflexus sp. Ai-910的丰度显著更高。
代谢通路分析显示，脂多糖组中以下通路活性增加：GLUCONEO-PWY (gluconeogenesis I)、GLUCUROCAT-PWY (superpathway of β-D-glucuronosides degradation)、PANTO-PWY (phosphopantothenate biosynthesis I)、PWY-5484 (glycolysis II)、PWY-6163 (chorismate biosynthesis from 3-dehydroquinate)、SER-GLYSYN-PWY (superpathway of L-serine and glycine biosynthesis I)。然而，GLYCOLYSIS通路活性受到抑制。
服用益生元1后，以下代谢通路活性相对于脂多糖组降低：Glycolysis I、Glycolysis II，而Adenine and adenosine salvage III通路活性增加。服用益生元2后，Pyruvate fermentation to isobutanol (engineered)代谢通路活性增加，Lactose and galactose degradation I通路活性降低。
讨论
基于组织学结果，粉末形式的墨角藻与海带益生元对肠道形态具有最显著的积极作用，可增加绒毛高度和隐窝深度，而脂多糖对肠道形态产生负面影响。
菌群分析显示，脂多糖组中Ligilactobacillus murinus、多种Alistipes菌种、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides uniformis、Bacteroides nordii、Duncaniella dubosii等菌丰度增加，这些变化与炎症、代谢紊乱及某些保护作用相关。益生元干预后，Akkermansia muciniphila、Anaerostipes rhamnosivorans、Butyricimonas virosa、Flavonifractor plautii、Dysosmobacter welbionis等有益菌丰度增加，而Ligilactobacillus murinus、Alkaliflexus sp. Ai-910等菌丰度降低。A. muciniphila与改善代谢、增强肠道屏障相关。A. rhamnosivorans产生丁酸盐，具有抗炎特性。F. plautii可减轻结肠炎。D. welbionis可抵抗肥胖和胰岛素抵抗。
代谢通路变化表明，脂多糖诱导了糖异生等相关通路的上调，而益生元干预后糖酵解通路活性发生变化，提示益生元有助于纠正与菌群失调相关的代谢紊乱。
本研究存在方法学局限，即缺少“补充益生元1但不注射脂多糖”和“补充益生元2但不注射脂多糖”的对照组，因此无法区分直接抗炎作用与一般菌群调节相关的间接作用。
结论
源自墨角藻与海带的益生元显著改变了脂多糖诱导炎症小鼠的肠道菌群组成和预测的代谢通路。这些调节包括降低糖酵解活性，这是纠正菌群失调的特征。研究结果支持了藻类源益生元在炎症性肠道菌群失调中的治疗潜力。
