苍白气芽孢杆菌接种剂通过引导功能性微生物演替优化高蛋白废弃物堆肥氮转化

《Microorganisms》：Aeribacillus pallidus Inoculant Orchestrates Functional Microbial Succession for Enhanced Nitrogen Transformation in High-Protein Waste Composting Suhua Li, Ming J. Wu, Qinhong Yang, Jia Yang, Hongmin Yang, Zhiyong Zhao and Hongbin Yin

本研究通过基因组学、实验室堆肥试验和微生物组分析，系统阐明了苍白气芽孢illus pallidus菌株60作为先驱接种剂，在蛋白密集的肉骨粉（MBM）堆肥中如何通过“生态位构建”驱动功能性微生物群落的定向组装，从而实现氮素保留和堆肥效率的协同提升。它为开发针对高蛋白废弃物的靶向生物强化策略提供了新范例。

　　

苍白气芽孢杆菌接种剂引导功能性微生物演替，增强高蛋白废弃物堆肥氮转化

1. 引言

肉骨粉（MBM）是动物尸体经炼制产生的蛋白副产品，其总氮含量约8%，但其中超过80%的蛋白质和17-26%的胶原蛋白结构稳定，限制了氮的有效利用。将其转化为有机肥的堆肥过程面临严峻的氮素流失（10-30%）挑战。堆肥中的氮转化网络复杂，涉及有机氮矿化、硝化、反硝化和固氮等多条竞争途径，理想的堆肥过程需在促进矿化和硝化的同时，最大化氮素进入微生物同化途径，并抑制反硝化和氨挥发。

生物强化，即通过添加特定微生物接种剂来优化堆肥进程，是应对上述挑战的潜力策略。然而，现有研究多集中于木质纤维素或油脂废物，针对MBM等高蛋白基质的专用接种剂稀缺。为此，本研究选取了一种从MBM堆肥中分离的、具有高热稳定性和强蛋白降解能力的菌株——苍白气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus）菌株60，探究其作为生物催化剂，在MBM堆肥中重新引导氮通量、提升氮素保留的效能。

2. 材料与方法

研究在实验室规模下，以MBM和小麦秸秆为原料，设置三个处理：接种A. pallidus菌株60（A_60）、添加市售有机分解剂（COM，含枯草芽孢杆菌和米曲霉）以及无菌对照（CON）。为期50天的堆肥过程中，系统监测了理化参数（温度、pH、电导率、总有机碳TOC、总凯氏氮TKN、铵态氮NH₄⁺-N、硝态氮NO₃^?-N、腐殖酸HA/FA）、关键氮循环功能酶活性（蛋白酶、氨单加氧酶AMO、硝酸还原酶NAR、亚硝酸还原酶NIR）及相关功能基因（aprA, amoA, nxrA, narG, nirK, nifH）丰度。此外，通过16S rRNA基因扩增子测序解析了细菌群落动态，并通过全基因组测序分析了A. pallidus菌株60的遗传潜力。

3. 结果

3.1. A. pallidus菌株60的氮素保留基因组潜力

菌株60的基因组大小为4.21 Mbp。基因组挖掘揭示了其强大的蛋白分解能力（包含23个推定的蛋白酶和64个肽酶基因）和完善的氮同化工具箱。它拥有同化型亚硝酸还原酶基因（nirA）、完整的GS/GOGAT/GDH途径基因，可实现高效的胞内铵同化。然而，其基因组中缺乏关键的硝化基因（amoA, nxrA）和气体生成反硝化步骤的基因（nirS/nirK, norB, nosZ）。这表明该菌株在基因层面上是倾向于氮素保留而非损失的类型。

3.2. 理化参数与成熟度演变

A_60处理引发了显著更强、更长的嗜热期，峰值温度达70°C，并维持≥60°C达7天，满足无害化要求。与对照相比，A_60显著加速了有机质矿化（TOC降解率17.49%），并提高了最终产物的氮素水平。在堆肥结束时（第50天），A_60处理的TKN浓度比COM和CON分别高10.87%和13.33%，NO₃^?-N浓度分别高18.65%和13.75%。同时，A_60处理的腐殖化程度更高，腐殖化指数（HA/FA）在第10天即超过成熟阈值1.0，最终达到10.74。

3.3. 微生物群落动态与演替

A_60处理驱动了一个清晰的两阶段微生物群落演替。在早期嗜热阶段（第3天），群落以厚壁菌门（Bacillota）为主，其中蛋白水解菌属Thermoactinomyces和Ammoniibacillus被显著富集。在堆肥成熟期（第22天后），群落转变为以变形菌门（Pseudomonadota）为主，其中假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas）成为优势菌属，而对照组中则以放线菌门和Saccharopolyspora为主。这种演替与A_60处理的温度曲线和理化变化相吻合。

3.4. 氮转化功能基因动态

功能动态与群落演替一致。早期，A_60处理显示出显著更高的蛋白酶活性和aprA基因丰度。随后，在嗜热后期和降温期，A_60处理的AMO酶活性和其编码基因amoA的丰度持续显著高于对照。代表硝化第二步的nxrA基因丰度在A_60处理的关键时间点也更高。相反，与氮损失相关的反硝化途径（NAR, NIR活性及narG, nirK基因）在大部分过程中被显著抑制。固氮基因nifH在A_60处理中的检出频率也更高。

3.5. 群落与功能的多变量整合

在A_60处理内进行的冗余分析（RDA）和相关性分析进一步阐明了机制。早期嗜热阶段的样品与温度、蛋白酶活性高度相关，并与Thermoactinomyces和Ammoniibacillus的富集位置对应。后期样品则与硝化功能（AMO）和NO₃^?-N含量强相关，并与假黄单胞菌属的出现相关联。Spearman相关分析证实，Thermoactinomyces和Ammoniibacillus与蛋白酶活性（ρ = 0.91, 0.94）和aprA基因丰度（ρ = 0.80, 0.85）呈显著正相关，而假黄单胞菌属则与AMO活性（ρ = 0.94）、amoA（ρ = 0.90）和nxrA（ρ = 0.84）的丰度呈强正相关。共现网络分析进一步整合了从早期分解者到后期与氮保留相关关键菌属的这种有序演替关系。

4. 讨论

本研究揭示了A. pallidus菌株60在MBM堆肥中的作用模式：它并非通过持续占据主导地位，而是作为“生态位构建者”，通过其强大的初始蛋白水解活性引发剧烈的产热和氨化反应，从而改变了堆肥微环境。这种经改造的高温、高铵环境，作为一种强大的选择压力，促进了功能性微生物群落的定向组装。具体表现为一个两阶段的演替：先是由其基因组预言的蛋白水解热菌（如Thermoactinomyces, Ammoniibacillus）主导的分解阶段，高效释放铵；随后，在条件变化后，过渡到一个由假黄单胞菌属等可能参与硝化的类群主导的氮转化与稳定阶段。这种“先驱驱动演替”的模式，使得整个系统在加速有机质降解的同时，将氮通量更多地导向了保留和稳定的途径（如NO₃^?-N和腐殖酸），并抑制了反硝化损失。该研究为针对特定废物基质的精准生物强化策略提供了理论基础。

5. 结论

本研究证明，利用A. pallidus菌株60进行生物强化，能够有效加速实验室规模MBM堆肥的成熟，并提高最终产物的相对氮素和腐殖酸含量。其核心机制在于接种剂通过创造特定的热生态位，引导了从早期蛋白水解菌群到后期硝化相关菌群的功能性微生物演替。对于高蛋白废弃物的堆肥化处理，建议在初期以1.0 × 10⁸CFU kg^?1干重的剂量接种，以最大化启动关键的产热和蛋白水解阶段，为后续的氮素保留奠定基础。未来研究可借助宏转录组学等手段，在关键演替节点验证这些相关类群功能基因的原位表达活性。