《Microorganisms》：Environmental and Climatic Drivers of Microsporidial Keratoconjunctivitis in Athletes: Molecular Evidence from Outbreaks in Japan
Mohamed Talaat Mohamed,
Masafumi Uematsu,
Yasser Helmy Mohamed,
Mao Kusano,
Daisuke Inoue,
Naoki Matsuya,
Akio Oishi and
Kenji Yagita
1. 引言
微孢子虫性角结膜炎 (MKC) 是一种日益受到关注的眼部感染，可影响免疫健全个体，尤其是在亚洲地区户外活动或运动中接触泥土、污物或污染水体的人群。其中，角膜微孢子虫 (V. corneae) 是最常被报道的致病菌种，在印度、新加坡、泰国等热带地区均有爆发或散发报道。MKC 通常表现为急性单侧或双侧结膜充血、异物感、畏光和浅层点状角膜炎，但由于临床表现重叠且临床医生认识不足，常被误诊为病毒性结膜炎。尽管对这种病原体的认识在增加，但 V. corneae 的环境传播途径仍不明确，能直接证明土壤或其他环境储库与人类感染相关的分子证据仍很稀缺。多项报告指出，MKC 的发病率在高湿度、高温和强降雨期间有所上升，而这些环境条件恰好有利于微孢子在土壤中存留。日本在 2022 年于长崎发生了首次 MKC 疫情。尽管日本历史上并不被认为是 MKC 的地方性流行区，但近期的气候波动，包括更温暖、更湿润的时期和偶发的土壤浸透，可能促进了 MKC 在温带地区的出现。在运动场训练的运动员在降雨后暴露风险增加。然而，迄今为止，尚无来自日本的研究提供分子证据证实当地环境储库与临床确诊的 MKC 病例之间存在联系。
本研究调查了 2022 年和 2023 年日本长崎免疫健全足球运动员中发生的 MKC 聚集性感染，旨在阐明环境暴露如何导致疾病在非流行地区的发生。我们致力于确认 V. corneae 是影响运动员的致病因子，检查临床与环境分离株之间的分子关系，并评估温度、湿度和降雨模式与疫情暴发时间的一致性。这些目标共同构成了一个方法学框架，旨在将临床诊断与环境储库检测相联系，为 MKC 疫情暴发期间的传播途径提供分子证据。
2. 材料与方法
我们采用靶向核糖体小亚基 (SSU) rRNA 基因的巢式 PCR 检测方法，对眼角膜样本、眼分泌物以及环境土壤和水样中的 V. corneae 进行分子检测。随后，通过 BLAST 比较和系统发育分析，确定临床菌株与环境菌株之间的亲缘关系。我们还分析了当地的气候变量，包括温度、湿度和降雨量，以评估其与疫情暴发时间的关系，并将此关联与之前印度的研究报道进行比较。
患者数据收集：在 2022 年和 2023 年，我们记录了长崎影响两个足球队共 16 名健康足球运动员的 MKC 疫情。数据来自长崎大学医院和松谷眼科诊所。首次疫情涉及 5 名患者，均来自同一支足球队。第二次疫情涉及 11 名患者，其中 10 名来自同一支足球队，1 名来自一所高中。从患者处收集角膜上皮刮片和眼分泌物样本进行 PCR 分析。首次疫情角膜样本的 PCR 和 DNA 测序已在之前的研究中描述。
环境采样：在 2023 年疫情后，我们从足球队俱乐部、高中及其周边地区采集了 15 份土壤和 11 份水样，并在 2022 年疫情后从足球队俱乐部训练场采集了 1 份样本。高中的样本是在足球场土壤被更换后采集的，而周边区域保持不变。足球队的训练场是经过良好栽培的草坪，施肥并灌溉。高中操场是沙质土壤。样本采集自足球训练场、附近公园、肥料、动物粪便以及各种水源，包括灌溉水、沥青路面的雨水和自来水。
PCR 方案：我们采用了多种 PCR 方法以确保致病生物体的准确检测。
方法⑤ (使用 Vf-F2/MSR1 引物进行第一轮扩增，随后使用 Vf-F2/Vf-R4 引物进行第二轮扩增的巢式 PCR) 可在无需测序的情况下高度特异性地检测 V. corneae。
土壤和水样的样本制备：对于土壤样本，将约 1 mL 土壤置于 15 mL 离心管中，加入 10 mL 洗涤液 (含 0.05% Tween-80 的蒸馏水)。涡旋振荡 15 秒，以 300× g 离心 1 分钟。取 2 mL 上清液转移至 2.0 mL 微量离心管中，以 10,000× g 离心 3 分钟。小心弃去上清，向沉淀中加入 100 μL 含有 5 mM EDTA 的 TE (Tris-EDTA) 缓冲液。
对于水样，将 10 mL 水与 50 μL 10% Tween-80 轻轻混合 (Tween-80 终浓度为 0.05%)，取 2 mL 混合物在 2 mL 管中以 10,000× g 离心 3 分钟。从 10 mL 样品中回收的所有沉淀物重悬于 100 μL 含 5 mM EDTA 的 TE 缓冲液中。
珠磨和 DNA 提取：将来自土壤或水的浓缩样本转移至含有 100 μL 0.5 mm 氧化锆珠的 2 mL 螺旋盖管中。使用 Disruptor Genie 进行珠磨均质。样品在室温下均质 5 分钟。DNA 提取使用 QIAamp DNA Mini Kit 并稍作修改。样品均质后，向螺旋盖管中的裂解液中加入 200 μL 缓冲液 ATL，15 μL 蛋白酶 K 和 200 μL 缓冲液 AL，涡旋振荡 15 秒。将管子置于 70 °C 孵育 1 小时。10,000× g 离心 1 分钟后，将裂解液转移至新管，与 200 μL 99.5% 乙醇混合。随后的 DNA 提取按照制造商的说明进行。最后，提取的 DNA 洗脱于 100 μL AE 缓冲液中。
半巢式 PCR 和分子鉴定：开发了半巢式 PCR 程序以扩增 V. corneae 小亚基 RNA 基因中的特异区域。第一轮 PCR 引物组包括 Vf2:5'-CCATGCATGTTTCCTCAATCAG (正向，新设计) 和 msprv1: 5'-GTTGAGTCAAATTAAGCCGCACA (反向，3'-端修饰)，用于扩增约 750 bp 的小亚基核糖体 RNA 基因部分区域，适用于序列分析。第二轮 PCR 引物之一，R4: 5'-CCTGCGTCTTATTCTGCCT (反向)，与 Vf2 配对用于扩增 115 bp DNA。使用 HotStarTaq DNA Polymerase 进行高特异性 PCR。我们的半巢式 PCR 方案如下：在第一轮 PCR 中，初始变性 (94 °C 15 分钟) 以激活酶，随后进行 40 个循环的变性 (94 °C 30 秒)，退火 (57 °C 1 分钟)，延伸 (72 °C 30 秒)，最后一步为终延伸 (72 °C 5 分钟)。在第二轮 PCR 中，方案大致相同，但退火条件更严格 (63 °C 30 秒)，共 25 个循环。从第一轮 PCR 中纯化 Vf2/MSRv 扩增产物，并使用桑格测序法确定其序列。扩增子 DNA 的序列相似性通过 NCBI 数据库中的 BLAST 进行确定。
我们比较了土壤和水样的 PCR 结果与疫情暴发期间收集的患者角膜刮片和眼分泌物样本的 PCR 结果。
天气数据分析：分析了日本气象厅和 World Weather Online 提供的 MKC 疫情期间的天气数据。然后将这些数据与印度进行的其他研究报告的 MKC 病例进行比较。
3. 结果
临床发现：所有受影响个体均为 17-36 岁的免疫健全男性。一名患者经历了三次再感染。患者经历了最佳矫正视力 (BCVA) 下降、发红、眼分泌物、疼痛、瘙痒和异物感。更严重的表现包括角膜混浊、多发性上皮下角膜浸润和眩光，这使得踢足球时难以看清球。
患者角膜和眼分泌物样本的 PCR 分析对 V. corneae 呈阳性。
所有患者治疗后均康复。患者使用伏立康唑滴眼液、1.5% 左氧氟沙星滴眼液、那他霉素眼膏和碘/聚乙烯醇滴眼液治疗。此外，仅对患有严重角膜混浊的患者处方 0.1% 氟米龙滴眼液，并密切监测这些病例是否有感染恶化迹象。建议他们在训练后定期清洗眼睛并使用碘滴眼液。
分子和环境分析：土壤和水样的 PCR 检测表明，方法⑤是最有效的 (图 1 和图 4)。
16 份土壤样本中有 4 份 PCR 检测对 V. corneae 呈阳性，这些样本来自足球队训练场、高中地下土壤和高中操场周围的种植区。所有 11 份水样对 V. corneae 均为阴性，但对其他微孢子虫物种呈阳性。在 16 名患者中，8 人接受了角膜刮片和 PCR 检测，结果均对 V. corneae 呈阳性。在 4 名有眼分泌物的患者中，1 名患者的眼分泌物样本进行了 PCR 检测，对 V. corneae 呈阳性。
V. corneae 分离株的 SSU rRNA 基因序列在 GenBank 进行了注册，登录号分别为 PV875095 (S4)、PV875116 (S5)、PV875206 (S7) 和 PV875207 (S8)。
通过 NCBI 数据库 BLAST 进行的扩增子 DNA 序列相似性结果详见相关表格。
系统发育分析表明，所有土壤来源的分离株都与先前报道的人源 V. corneae 菌株 NAGASAKI-C2 紧密聚类，表明环境和临床分离株具有共同的近期祖先。在样本 S5、S7 和 S8 中观察到的高序列同一性 (99%) 表明，这些环境菌株与疫情期间感染运动员的致病菌株相同或几乎相同。尽管 S4 显示出略低的相似性 (94%)，但其在同一进化枝内的位置表明它代表了一个密切相关的谱系，而非不同的物种。
天气相关性：2022 年 8 月和 9 月，长崎报告了 5 例 MKC 病例，2023 年 7 月至 10 月报告了 11 例。MKC 往往在达到或超过以下天气条件的月份之后发生：温度 ≥23 °C，湿度 ≥70%，降雨量 ≥200 mm。这种模式与印度的研究结果一致。
在上述天气条件与病例发病之间观察到大约 3-5 周的滞后期。
4. 讨论
据我们所知，本研究首次利用分子流行病学技术，清晰地揭示了日本土壤与 V. corneae 引起的 MKC 之间的关系。来自环境和临床样本的分子确认，结合 BLAST 和系统发育聚类分析，结果一致，表明土壤是主要传播来源，而水体中则没有 V. corneae。MKC 疫情在雨季，经过一个月的高温、高湿和强降雨后增加。疫情发生在免疫健全的足球运动员中，强调 MKC 不再局限于免疫功能低下人群。这些发现凸显了在角结膜炎病例临床评估中考虑环境暴露的重要性。
临床影响：尽管 MKC 在大多数病例中是自限性的，但它可能导致暂时性视力障碍，并扰乱体育训练和表现以及户外职业活动。KC 涉及结膜和角膜的炎症，环境暴露可激活眼表的先天免疫通路。当上皮细胞检测到病原体时，膜受体如 Toll 样受体和细胞因子受体会触发信号级联。MAPK 通路通过激活如 AP-1 等转录因子，对放大炎症至关重要，从而增加包括 IL-1 和 TNF-α 在内的细胞因子产生，并参与炎症反应。此外，病原体相关刺激可激活 PI3K/Akt 通路，该通路与 mTOR 相互作用，在感染期间调节免疫细胞活性和宿主防御机制。
在非地方性流行国家（如日本）的免疫健全个体中暴发疫情，引起了体育界的高度关注。本文提出的诊断方法使临床医生能够区分 MKC 与其他感染性角结膜炎。我们的研究结果支持将环境监测纳入 MKC 常规疫情管理。使用本文描述的分子工作流程进行土壤检测是可行、快速且适用于学校运动场、体育设施和社区娱乐区域的。
诊断挑战与 PCR 优化：由于非特异性症状和微孢子虫孢子的顽强性，MKC 的早期准确诊断仍然具有挑战性。我们优化了一个具有卓越特异性和灵敏度的巢式 PCR 系统 (Vf-F2/MSR1 → Vf-F2/R4) 用于检测环境样本中的 V. corneae。
分子与环境：MKC 感染更可能源于土壤或泥浆，因为 PCR 在土壤样本中检测到了 V. corneae，这与患者角膜刮片和眼分泌物样本的 PCR 结果一致。这得到了系统发育树和 BLAST 分析的支持，该分析显示长崎-C2 与土壤样本 S5、S7 和 S8 之间分别具有高度相似性。
然而，水样对 V. corneae 呈阴性，但对其他微孢子虫物种呈阳性。水样结果与先前泰国的报告不同，后者在水样中检出了 V. corneae。这可能归因于 PCR 技术的差异、日本和泰国水处理方式的差异，或 V. corneae 菌株在泰国传播途径的不同。
BLAST 分析和系统发育拓扑结构支持了环境与临床之间的直接联系。它们提供了强有力的分子证据，表明 2022-2023 年疫情暴发的环境分离株并非偶然的土壤微孢子虫，而是与受影响运动员中传播的病原谱系相同。
特别是，分离株 S4 值得关注，因为它与人类眼部菌株的遗传学接近性。其在系统发育上与人眼感染 V. corneae 的聚类表明，它可能是土壤中存在的潜在病原体。这一发现支持了早期检测此类菌株可能在预防未来疫情中发挥关键作用的观点。
气候因素与季节性风险：天气分析报告强调了天气条件与眼部微孢子虫感染之间的关系，雨季被确定为重要的风险因素。疫情暴发与气温升高、湿度增加和降雨量增多的气候条件相吻合。这些阈值可能促进了 V. corneae 在土壤中的存留和孢子形成。随着全球变暖加剧降雨变率、温度和湿度，类似的疫情可能会在以前没有的地区出现。
预防策略应包括运动场的环境监测、公众眼卫生教育以及接触土壤后尽早使用抗菌滴眼液。建立 MKC 季节性预警系统有助于预防该疾病的未来暴发。在强降雨、高温或高湿时期后进行定期监测，可以预警土壤中病原体负荷的增加，从而采取预防性干预措施。通过将分子检测、气候驱动因素和临床结果联系起来，本研究为管理环境介导的眼部感染提供了一个转化框架。
研究局限性：本研究在特定地理区域进行，病例数量有限。此外，还存在 PCR 污染风险、采样时间代表性以及气候阈值描述性等问题。需要在不同气候带和土壤类型进行更广泛的监测，以验证本研究中确定的环境阈值。
未来研究方向：我们的后续研究旨在解决关于观察到的与特定天气条件相关的病例增加背后的流行病学问题。我们旨在理解这些条件与疫情暴发之间几周滞后期背后的原因。鉴于 V. corneae 存在于雨水或日常供水中的可能性几乎为零，有理由假设其来源是土壤。我们假设 V. corneae 的自然宿主尚未被确定或报告，并且可能存在于土壤中。我们认为温度、湿度和降雨量的增加导致宿主种群密度增加，从而导致环境中 V. corneae 浓度升高。有必要进行进一步的调查，以阐明 V. corneae 的性质和生活史，从而为开发更有效的 V. corneae 感染预防方法提供信息。
5. 结论
本研究报告了日本首次有记录的 MKC 疫情，并提供了分子证据，证明 V. corneae 污染的土壤是健康人群中的环境储库，而水源则没有该生物体。土壤与患者分离株之间密切的遗传相关性支持了直接环境传播。虽然无法最终确定因果关系，但研究结果强调了环境暴露和气候条件对疾病发生的潜在影响。本研究开发的巢式 PCR 检测方法能够灵敏地检测环境样本中的 V. corneae，为针对性监测和早期干预提供了一个实用工具。随着气候模式持续变化，类似的疫情可能在以前被认为是非地方性流行的地区出现。将分子诊断与环境监测相结合，对于保护高危人群和确保户外活动的安全条件至关重要。
