《Agronomy》：Identification and Expression Analysis of R2R3-MYB Transcription Factors Associated with Flower Color Variation in Aquilegia oxysepala
Tingting Ma,
Yongli Cheng,
Dan Chen,
Yuan Meng,
Yunwei Zhou,
Ying Qian and
Yun Bai
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本研究针对具有特色花色变异和潜在园艺价值的华北耧斗菜（Aquilegia oxysepala），首次系统鉴定了其R2R3-MYB转录因子家族成员。通过结合生物信息学分析与不同花期转录组数据，筛选出与花色变异密切相关的关键候选基因AoMYB32和AoMYB34，为深入解析华北耧斗菜花色形成的分子机制提供了重要的理论依据和基因资源。
本研究聚焦于华北耧斗菜（Aquilegia oxysepala）及其自然变型白花华北耧斗菜（A. oxysepala f. pallidiflora），旨在探究与花色变异相关的关键调控因子，特别是R2R3-MYB转录因子家族。
1. 引言背景：花色、花色素苷与MYB转录因子
花色是观赏植物的重要品质性状，直接影响其观赏价值与育种潜力。花色素苷是水溶性天然色素，属于类黄酮化合物，是决定花、果、叶等器官呈现橙红至蓝紫等多种颜色的关键物质。其生物合成途径由一系列结构基因编码的酶催化，主要包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）、查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）等。这些结构基因的表达受到转录因子的精密调控，其中MYB、bHLH和WD40蛋白家族构成了核心的调控复合体（MBW复合体）。
MYB蛋白是植物中最大的转录因子家族之一，是花色素苷生物合成的主要调控因子。根据所含MYB结构域的数量，MYB家族可分为不同亚家族，其中R2R3-MYB亚家族分布最广、成员最多，在植物生长、发育、次生代谢（尤其是花色素苷合成）等多种生物学过程中扮演着至关重要的角色。例如，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114能够促进花色素苷的合成，而AtMYB4则起抑制作用。
华北耧斗菜萼片呈深红色，而其自然变型白花华北耧斗菜萼片呈淡黄色，二者在萼片颜色上存在显著差异，是研究花色形成分子机制的理想材料。目前，关于华北耧斗菜中参与花色素苷生物合成的R2R3-MYB基因家族的研究相对较少。本研究旨在系统鉴定华北耧斗菜中的R2R3-MYB转录因子家族成员，并通过多组学联合分析，筛选出与花色变异形成相关的关键候选基因。
2. 材料与方法：系统鉴定与多层次分析
研究材料为华北耧斗菜（PS）和白花华北耧sepala（WS），在三个不同的花发育阶段（花蕾期Bud、开花前期PrA、开花后期PoA）采集萼片样品。通过生物信息学方法，从华北耧斗菜中鉴定出90个R2R3-MYB家族成员，命名为AoMYB1至AoMYB90，并对其进行了系统分析：
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理化性质与亚细胞定位：分析表明，大部分AoMYB蛋白不稳定且为亲水性，主要定位于细胞核。
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系统进化分析：构建了包含90个AoMYB和拟南芥R2R3-MYB蛋白序列的系统发育树，将AoMYB分为29个亚家族（A1-A29）。其中A27亚家族成员最多（10个）。初步推测，A18（S7）亚家族中的R2R3-MYB基因可能与类黄酮合成相关，而A15（S6）亚家族中的AoMYB17可能在花色素苷合成中发挥作用。
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基因结构与保守基序：所有蛋白序列均包含保守基序1，基序2和3也广泛存在。该基因家族成员通常含有1至12个外显子，多数具有3个外显子。保守结构域分析显示，R2和R3结构域均含有三个高度保守的色氨酸（Trp, W）残基，这是MYB结构域的典型特征。
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顺式作用元件分析：对启动子区2000 bp的序列进行分析，发现98.9%的基因含有光响应元件，97.8%含有激素响应元件（如生长素、脱落酸、赤霉素、茉莉酸甲酯、水杨酸响应元件），此外还包含低温、干旱、厌氧等胁迫响应元件。
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染色体定位：90个AoMYB基因分布在7条染色体和1个未锚定的scaffold上，其中1号和3号染色体上分布的基因最多（各22个）。
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表达模式与相关性网络分析：基于转录组数据，筛选出32个R2R3-MYB家族的差异表达基因（DEGs）。其中，AoMYB32和AoMYB34在PS的开花前期（PrA）特异性显著上调，而在WS的同期表达水平始终较低。相关性网络分析显示，AoMYB34与六个花色素苷合成相关功能基因（PAL-2、C4H、4CL、CHS、F3′5′H、ANS）呈显著正相关。
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RT-qPCR验证：选择了AoMYB17、AoMYB30、AoMYB32和AoMYB34四个基因进行验证。结果证实，AoMYB32和AoMYB34在PS的PrA期表达量显著高于WS，其表达模式与多数花色素苷合成相关功能基因的表达差异同步。
3. 结果与讨论：关键候选基因的发现与功能推测
综合各项分析结果，本研究推测AoMYB32和AoMYB34是参与华北耧斗菜花色变异形成的候选基因。这一推断基于以下几点：
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表达模式的高度特异性：转录组和RT-qPCR数据均显示，AoMYB32和AoMYB34在深红色花（PS）的PrA期（花色差异开始显现的关键时期）特异性高表达，而在淡黄色花（WS）的整个花期表达量都很低。这种表达模式与花色素苷合成结构基因的表达高峰时期（PrA期）以及花色表型差异的出现时期高度吻合。
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与花色素苷合成通路的强关联性：相关性网络分析表明，AoMYB34与花色素苷合成通路中的多个关键结构基因（PAL-2、C4H、4CL、CHS、F3′5′H、ANS）存在显著正相关，尤其是它与ANS（花色素苷合成的关键酶基因）的关联是独一无二的。这表明AoMYB34可能正调控花色素苷的生物合成。
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系统进化上的功能提示：根据与拟南芥同源基因的比对，AoMYB17、AoMYB30等基因所在的亚家族（A15/S6和A18/S7）中包含已知参与类黄酮/花色素苷代谢调控的R2R3-MYB成员，提示这些基因也可能参与花色调控网络。
研究还讨论了R2R3-MYB转录因子调控花色的可能机制，包括直接激活或抑制花色素苷结构基因的表达，以及可能与bHLH、WD40蛋白形成MBW复合体来协同行使功能。在华北耧斗菜中，AoMYB32和AoMYB34是否通过此类机制发挥作用，有待后续通过异源表达、基因沉默等功能实验进行验证。
4. 结论与展望
本研究在华北耧斗菜中系统鉴定了90个R2R3-MYB转录因子基因，并对其进行了全面的生物信息学分析。通过整合表达谱、相关性网络及RT-qPCR验证，初步推断AoMYB32和AoMYB34是可能与华北耧斗菜花色变异形成相关的候选基因。该研究结果为后续深入解析AoMYB基因在华北耧斗菜花色形成中的分子机制提供了重要的理论依据和遗传资源。未来研究将增加实验重复，并利用异源表达、基因编辑等技术对候选基因进行功能验证，以期最终阐明华北耧斗菜绚丽花色背后的遗传密码。
