《Agronomy》：Growth-Time-Controlled CuO Nanoflower Electrodes for H2O2 Sensing and Assessment of MgO Nanoparticle-Mediated Drought Stress Mitigation in Oat (Avena sativa) and Rye (Secale cereale)
Irena Mihailova,
Marina Krasovska,
Eriks Sledevskis,
Vjaceslavs Gerbreders,
Jans Keviss,
Valdis Mizers and
Andrejs Bulanovs
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这篇研究性论文（非综述）提出了一种基于纳米技术的集成策略，用于同步监测和缓解干旱胁迫诱导的作物氧化损伤。研究合成了形貌可控的CuO纳米花电极，用于高灵敏度检测植物中的氧化应激标志物H2O2（检出限1.9 μM）。同时，研究发现氧化镁纳米颗粒（MgO NPs）可有效减轻燕麦和黑麦的氧化损伤，显著降低H2O2积累（最高达63%），并改善植物生长与叶绿素含量。该工作为作物胁迫诊断与精准农业干预提供了一个集成传感-缓解的稳健框架。
引言
干旱胁迫是限制全球植物生长和农业生产力的最关键非生物胁迫因素之一。水分亏缺会扰乱气孔功能、光合作用和细胞代谢，导致氧化还原稳态失衡。其主要后果之一是活性氧（ROS）的过度积累，如超氧阴离子（O2·?）、羟基自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）。在受控浓度下，ROS可作为重要的信号分子，但在干旱胁迫期间它们的过量产生会诱导氧化应激，导致脂质过氧化、蛋白质氧化、DNA损伤，最终引发细胞死亡。其中，H2O2因其相对稳定性、跨膜扩散能力以及作为信号分子和氧化应激介质的双重作用而显得尤为重要。因此，准确、灵敏地检测植物中的H2O2对于理解干旱诱导氧化应激的动态和评估胁迫缓解策略的有效性至关重要。
在众多候选材料中，氧化铜（CuO）纳米结构在非酶电化学传感方面表现出特别的潜力。CuO是一种具有窄带隙（约1.2 eV）的p型半导体，通过Cu2+/Cu+的易氧化还原循环赋予其强大的电催化活性，使其在H2O2分解过程中实现高效的电子转移。这种固有的催化活性消除了对酶固定化或外部介体的需求，简化了传感器设计，同时保持了高性能。CuO的一个主要优势是其形貌依赖的功能性：纳米花、纳米棒、纳米片和分层CuO结构都提供了丰富的活性位点和有利的电荷传输特性。
纳米技术最近已成为改善植物在干旱条件下恢复力的一个有前景的策略。包括氧化铈、氧化锌、二氧化钛和碳基纳米材料在内的工程纳米颗粒通过模拟酶促ROS清除或刺激植物内源防御机制，已显示出抗氧化特性。除了直接的ROS解毒作用，纳米颗粒还可以改善水分保持、养分吸收和光合效率，从而缓解干旱诱导胁迫的多个方面。氧化镁纳米颗粒（MgO NPs）作为一种有前景的增强植物耐旱性的制剂而出现。镁在叶绿素生物合成、酶活化和光合效率中起着核心作用，使MgO NPs成为一种潜在的双功能材料，既可作为养分来源，又可作为胁迫恢复力的诱导剂。
材料与方法
采用一步水热氧化法在铜基底上直接合成纳米结构样品。将清洁后的铜丝浸入由10 M NaOH、1 M (NH4)2S2O8和去离子水组成的反应混合物中，在90 °C的烘箱中加热3小时，随后自然冷却至室温。合成的样品用蒸馏水彻底冲洗以去除残留反应物，并在90 °C下干燥3小时以去除残留水分。生长途径由溶解-沉淀机制控制。
MgO纳米结构通过水热合成法制备。将六水合硝酸镁溶解在去离子水中，随后加入0.1 M NaOH。白色悬浮颗粒的出现表明Mg(OH)2纳米颗粒的形成。混合物在磁力搅拌约60分钟后转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，在150 °C加热4小时。冷却后，产品用去离子水和乙醇反复洗涤直至pH达到中性（约7）。获得的沉淀物然后在4000 rpm下离心10分钟，最后在400 °C下煅烧4小时得到MgO纳米结构。
电化学测量采用三电极系统：CuO纳米线板作为工作电极，碳棒作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极。循环伏安法在0.1 M NaOH（pH = 12.7）中，在0.1至-0.9 V（相对于Ag/AgCl）的电位范围内，以100 mV·s?1的扫描速率进行。使用浓度范围为0至3 mM的过氧化氢溶液进行校准。采用差分脉冲伏安法（DPV）评估传感器性能，电位范围为+0.10至-1.10 V，脉冲高度为50 mV，脉冲距离为50 ms，脉冲宽度为25 ms。
将燕麦和黑麦幼苗在泥炭基通用基质中培养。从第二周开始，幼苗被分为六个处理组。对照组继续每天接受20 mL去离子水。另外两个水分充足组用浓度为50和100 mg·L?1的MgO纳米颗粒悬浮液灌溉。为诱导干旱胁迫，一组每隔一天用20 mL去离子水浇水，而另外两个干旱胁迫组在相同的减少灌溉制度下接受MgO纳米颗粒处理（50或100 mg·L?1）。所有处理维持三周，总生长周期为四周。一个月后，评估燕麦和黑麦幼苗的形态参数，包括第一叶长度、总地上部长度、鲜重和干重。为了进行分析，将植物材料处理成乙醇或碱性提取物。
结果与讨论
通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）研究了CuO纳米结构的时间依赖性生长，揭示了随着水热氧化时间从30分钟增加到5小时，从初始成核到复杂分层形态的渐进转变。在30分钟时，铜表面均匀覆盖着小而致密的晶核，这是早期成核阶段的特征。在1小时时，这些晶核演变成短的纳米片，使薄膜具有略微粗糙但仍致密的外观。到2小时，纳米片伸长并开始垂直取向，形成松散组织的花瓣状结构。在3小时时，出现了清晰的三维微花结构，由重叠的CuO花瓣组成。这些特征在4小时后变得更大、更致密，形成了具有高表面粗糙度和丰富开放空间的连续网络。然而，到5小时时，形态发生显著变化：单个纳米花合并成更致密的薄膜，其中花瓣强烈共生。尽管涂层仍然保持分层结构，但相邻结构的合并减少了可接触空隙的数量，并导致有效表面积相比3-4小时观察到的更开放结构有所减少。这种演变与CuO的溶解-沉淀生长机制一致。延长反应时间促进了纳米片的二次生长和聚集，首先增强了表面复杂性，然后在更长的持续时间下驱动结构粗化和部分表面致密化。
合成的MgO纳米颗粒由通常厚度低于20 nm的小型初级纳米结构组成，这些结构在干燥时聚集成不规则的次级团簇。这些团簇尺寸可达约200 nm，形成高度纹理化和多孔的形态。初级纳米颗粒显示出短棒状、板状和角状的混合形状，表明在合成过程中发生了快速成核和各向异性生长。这些纳米颗粒的致密堆积产生了具有众多暴露边缘、角落和颗粒间空隙的团聚体，这些已知特征可增强表面反应性。能量色散X射线光谱（EDS）微量分析进一步证实了材料的元素组成，显示氧（62.29 wt %）和镁（37.71 wt %）是主要贡献者，与MgO的预期化学计量一致。EDS谱中没有显著的杂质峰，支持了高纯度MgO纳米颗粒的成功形成。
通过循环伏安法研究了CuO纳米结构电极在0.1 M NaOH中对过氧化氢的电催化响应。在无H2O2（基线）的情况下，仅观察到可忽略的电流，表明电极在支持电解质中的稳定性。随着H2O2浓度（0.1-3 mM）的增加，CV曲线显示出阴极和阳极峰值电流的逐渐增强，对应于Cu0/Cu+/Cu2+氧化还原转变与过氧化物氧化和还原的耦合。电流的系统性增加证实了CuO纳米结构的电催化活性。选择0-3 mM的H2O2浓度范围是因为它涵盖了在真实植物提取物中观察到的过氧化物水平，并与非酶H2O2传感器常用的校准范围相符。该范围的上限远高于植物组织或其他生物体中发现的任何生理相关H2O2浓度，这些浓度通常处于低微摩尔至低数百微摩尔区间。
将阴极峰值电流值与H2O2浓度作图。CuO纳米结构电极在0.2-3.0 mM浓度范围内对H2O2表现出线性电流响应（R2= 0.989），表明是扩散控制的电化学过程，而较低浓度（0-0.2 mM）偏离线性，因此被排除在校准分析之外。严格在验证的工作范围内进行线性回归以确保准确定量。传感器显示出2.00 mA·mM?1的灵敏度，而检测限（LOD）确定为12.3 μM（假设信噪比为3）。这些结果反映了分层CuO纳米结构提供的高密度电活性位点和高效电荷传输路径，突出了其适用于非酶H2O2传感。
在存在H2O2的情况下，研究了扫描速率对CuO纳米结构电极电化学行为的影响。在25至150 mV·s?1的扫描速率下记录的循环伏安图显示，阳极和阴极峰值电流都随着扫描速率的增加而逐步增加，而伏安图形状保持一致。峰值电流与扫描速率平方根之间的关系表明，在低于100 mV·s?1的扫描速率下获得的线性相关性表明氧化还原过程主要是扩散控制的。在高于100 mV·s?1的扫描速率下，电流增加变得不那么明显，表明出现了动力学限制；因此，选择100 mV·s?1作为最佳扫描速率。
通过循环伏安法评估了在不同生长持续时间合成的CuO电极在存在H2O2的情况下的催化活性。观察到了明显的电化学行为差异，这与在不同合成时间形成的纳米结构的形态和表面特征直接相关。在较短的持续时间（30分钟和1小时），电流响应相对较低，表明表面发育不足和活性位点数量有限。随着合成时间增加到2小时和3小时，电极在阳极和阴极峰值电流上显示出显著增强，表明由于形成排列良好、高表面积的CuO纳米结构，催化活性得到改善。然而，对于在延长生长时间（4小时和5小时）制备的电极，电流响应再次下降。这种减少归因于纳米结构的聚集和层致密化，正如扫描电镜图像中所观察到的，这减少了可接触表面积并阻碍了质量传输。总体而言，在3小时合成的电极显示出最高的电流响应和最明显的氧化还原特征，突出其作为H2O2检测的最佳形态。
使用DPV在含有不同H2O2浓度（0-1500 μM）的0.1 M NaOH溶液中评估了优化的CuO纳米结构电极对过氧化氢检测的电催化活性。如图3所示，在约-0.7 V处出现了一个明确的阴极峰，随着过氧化物浓度的增加逐渐增强，表明H2O2在CuO表面被高效催化还原。这种行为反映了CuO纳米结构的强大电催化活性及其在定量传感应用中的适用性。
校准曲线显示了还原电流与H2O2浓度之间的线性关系，具有优异的相关系数（R2= 0.998）。根据该斜率，确定电极灵敏度为11.92 mA·mM?1·cm?2。计算出的检测限为1.9 μM（假设信噪比为3）。从校准图获得的灵敏度值清楚地证明了DPV技术与CV相比具有更优越的分析性能。这种近六倍的灵敏度提高突显了DPV在定量检测低浓度H2O2方面的更大适用性。DPV中观察到的增强响应主要源于其脉冲电位波形，该波形有效地最小了CV中导致背景噪声的电容（非法拉第）电流。在CV中，连续电位扫描导致显著的双层充电，部分掩盖了法拉第信号并降低了表观灵敏度。相比之下，DPV在增量基电位上叠加小电位脉冲，允许在电容分量衰减后对电流进行采样。这种选择性测量增强了信噪比，改善了峰分辨率，并能够更精确地区分参与H2O2还原和氧化的紧密间隔的Cu0/Cu+和Cu+/Cu2+氧化还原转变。DPV更高的灵敏度还可归因于在短脉冲持续时间内更有效地利用电活性表面位点以及减少的扩散限制。
为了评估CuO纳米结构电极在复杂植物基质中对H2O2检测的选择性，选择了柠檬酸、抗坏血酸、氯化钠、葡萄糖、硝酸钾和尿素作为代表性干扰物。这些化合物代表了植物提取物中常见的主要类别物质，可能影响电化学测量，包括有机酸、抗氧化剂、碳水化合物、无机盐和含氮代谢物。使用DPV进行研究，每种化合物测试浓度为1 mM。如图所示，对H2O2的DPV响应在-0.7 V附近表现出明确界定的阴极峰，对应于H2O2在CuO表面的电化学还原。加入单个干扰物后，阴极峰位置和强度基本保持不变，表明干扰可忽略不计。电流幅度的微小变化归因于离子强度的变化或弱吸附效应，而非直接的电化学干扰。当所有干扰物同时添加时，-0.7 V处的阴极峰仍然清晰可见，其高度与纯H2O2相比基本不变，证实了CuO电极即使在复杂化学环境中也具有高选择性。背景电流的变化主要在特征性H2O2还原区域之外观察到，反映了非法拉第贡献而非真正的分析干扰。
评估了脉冲宽度对0.1 mM H2O2的DPV响应的影响。在所有测量中，H2O2的特征性阴极还原峰在-0.70 V附近持续观察到，证实了CuO表面电化学过程的稳定性。在较低的脉冲宽度（30-40 ms）下，峰发育不良、更宽，且强度显著降低，反映了脉冲持续时间不足以进行完全的法拉第电荷转移。在这些条件下，短采样间隔增强了电容贡献，同时限制了扩散控制的电子转移，从而减少了可观察到的法拉第信号。将脉冲宽度增加到50-70 ms显著增强了峰强度，并产生了更尖锐、明确界定的信号。这种改善可归因于更长的脉冲间隔，使得电极表面的弛豫和电子转移更有效，使系统达到准稳态，此时H2O2扩散到表面活性CuO位点成为主导。因此，在此中间状态下，电流振幅和信号稳定性都最大化。值得注意的是，在60 ms处获得了最明显和可重现的峰，表明该脉冲宽度在法拉第响应和最小化电容背景之间提供了最佳平衡。在脉冲宽度高于80 ms时，峰强度持续增加，表明在研究的范围内未达到饱和，并且延长的脉冲持续时间促进了H2O2更完全的电化学还原。伏安图的一个显著特征是，随着脉冲宽度增加，H2O2还原峰逐渐向右移动，朝向更正的电势，特别是在70-80 ms以上。这种正向移动可归因于CuO表面的长时间极化，这增加了表面还原的程度并暂时改变了界面电场。延长的脉冲持续时间促进了吸附中间体（例如HO·物种）的积累、局部电荷再分布以及CuO向较低氧化态（Cu(II)/Cu(I)）的部分转化，从而降低了H2O2还原所需的动力学过电位。因此，还原过程在稍微更正的电势下发生。考虑到峰强度、峰锐度和最小电位位移之间的平衡，选择50-60 ms的脉冲宽度作为可靠定量测量的最佳值。
燕麦和黑麦样本的形态测量显示，总体而言，黑麦似乎对干旱更具抗性，这体现在干旱胁迫和水分充足对照植物之间视觉和形态特征的差异较小。施用MgO纳米颗粒对燕麦和黑麦的植物生长和生物量产生了明显的剂量依赖性效应。在燕麦中，在正常浇水下补充50或100 mg·L?1MgO纳米颗粒，使总长度分别增加了8%和24%，地上部伸长增加了15%和35%，鲜重增加了-3%和22%，干重增加了-33%和0%。在干旱胁迫下，暴露于100 mg·L?1MgO的植物在总长度、鲜重和干重方面比干旱对照分别提高了53%、84%和33%，而50 mg·L?1则产生了较小的增益，分别为26%、21%和0%，表明存在剂量依赖性响应。如图所示，用100 mg·L?1纳米颗粒处理几乎完全恢复了植物形态：干旱胁迫样本的形态指数与在正常浇水下接受相同纳米颗粒浓度的植物相当，并且显著长于水分充足的对照。相比之下，纳米颗粒浓度降低两倍导致显著差异。在水分充足的条件下，用50 mg·L?1处理的植物比未处理的对照显示出更长的叶子，与较高剂量相比仅略有减少。然而，在此较低浓度下的干旱胁迫植物，尽管相对于干旱对照有所改善，但仍然显示出叶长显著短于水分充足对照和相应的水分充足纳米颗粒处理。此外，这些干旱胁迫植物与干旱对照一样，表现出叶片黄化，这通常与活力降低相关。在黑麦中，在最佳浇水条件下，50 mg·L?1MgO使总长度增加了23%，地上部伸长增加了24%，鲜重和干重分别增加了79%和96%；较高剂量使长度增加了10%，鲜重和干重分别增加了43%和66%。在干旱条件下，MgO仍提供了实质性的保护，与干旱对照相比，长度增益为8-11%，鲜重增益为78-118%，干重增益为97-125%。总体而言，MgO纳米颗粒改善了两种植物的生长性能，燕麦表现出更明显的剂量依赖性。
燕麦和黑麦叶片的元素（EDS）微量分析表明，MgO纳米颗粒处理在水分充足和干旱条件下持续增强了两者作物中镁的积累。在燕麦中，镁含量从0.35 wt%（对照）增加到1.21-1.48 wt%（使用MgO NPs），在干旱条件下，从0.37 wt%（干旱对照）增加到1.38-1.49 wt%（使用纳米颗粒）。同样，黑麦显示镁富集从0.98 wt%（对照）增加到1.12-1.42 wt%（使用纳米颗粒），在干旱条件下，从0.87 wt%（干旱对照）增加到1.09-1.35 wt%。这些结果表明两种植物中镁的高效吸收，由于燕麦的基线镁水平较低，显示出相对更强的响应。在两种作物中，干旱胁迫增加了碳含量并降低了氧含量，而纳米颗粒处理有助于维持更平衡的元素组成。其他养分（P, S, K, Ca）仅表现出微小的、非系统性的波动，表明MgO纳米颗粒主要改善了镁的有效性，而没有破坏整体养分稳态。总体而言，补充MgO纳米颗粒增强了燕麦和黑麦的叶片镁状态，并有助于在干旱条件下形成更稳定的养分分布。
燕麦和黑麦样本中色素的吸收测量显示，紫外-可见吸收光谱显示出特征性的叶绿素峰，并说明了MgO纳米颗粒在对照和干旱条件下对色素含量的影响。在所有处理中，可以区分两个主要吸收区域：蓝色区域（约430-450 nm）的一个宽带主要对应叶绿素a，以及红色区域（约660-680 nm）的一个带代表叶绿素a的Qy跃迁，其中有一些叶绿素b的贡献。460-480 nm附近的肩峰反映了叶绿素b和类胡萝卜素的Soret带，而300至350 nm之间的宽特征归因于酚类化合物和紫外线屏蔽色素。
对照植物显示出典型的叶绿素吸收，而干旱胁迫植物在蓝色和红色区域都表现出明显的下降，表明叶绿素含量减少。用MgO纳米颗粒处理的植物在正常浇水和干旱胁迫下都显示出明显的改善。在正常浇水下，与对照相比，50和100 mg·L?1的MgO增加了叶绿素a和b峰的吸光
