《Pathogens》：Carcass-Based Surveillance of Amphibian Herpesviruses, Ranaviruses and Batrachochytrium dendrobatidis in Schleswig-Holstein, Northern Germany
Natalie Steiner,
Lotte C. Striewe,
Christoph Leineweber,
Sara Grau Camps,
Peter Wohlsein,
Frederik Elze,
Simon Rohner,
Rachel E. Marschang and
Ursula Siebert
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本研究通过对德国石勒苏益格-荷尔斯泰因州187份两栖动物尸体进行分子与组织学分析，揭示了蟾蜍疱疹病毒1型（BfHV1）和蛙疱疹病毒3型（RaHV3）在当地的广泛流行，而蛙壶菌（Bd）和蛙病毒检出率极低。研究强调了基于尸体的被动监测在揭示病原体存在方面的价值，同时也指出了该方法在评估病变、控制污染和采样偏差方面的固有局限性，为理解两栖动物疾病生态提供了新数据。
引言
全球两栖动物种群正经历着急剧的衰退，其灭绝速率估计比背景水平高出200倍。栖息地丧失、气候变化、入侵物种和过度开发等多种因素是导致这一衰退的原因，而传染病是其中最主要的驱动因素之一。在德国，两栖动物病原体的研究已取得一定进展，蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis, Bd）在全国广泛分布，蝾螈壶菌（Batrachochytrium salamandrivorans, Bsal）则是蝾螈种群衰退的主要推手。相比之下，蛙病毒的报道较为零星。此外，疱疹病毒，特别是隶属于异疱疹病毒科（Alloherpesviridae）的蟾蜍疱疹病毒1型（BfHV1）和蛙疱疹病毒3型（RaHV3），在德国的两栖动物中也时有检出。尽管研究日益增多，但关于德国北部地区两栖动物病原体的系统性数据，特别是其共同存在（co-occurrence）和对种群水平的影响，仍然有限。石勒苏益格-荷尔斯泰因州拥有丰富的两栖动物多样性，然而系统性的健康监测却有所欠缺。基于尸体的非侵入性采样为此提供了一种有价值的补充方法，它可以在不影响脆弱种群的情况下检测病原体，并且更可能捕获到活体调查中常被忽略的晚期病理变化。本研究的目的是通过机会性采样，检测在石勒苏益格-荷尔斯泰因州收集的死亡无尾类动物中的Bd、蛙病毒、BfHV1和RaHV3，以填补相关知识空白，并评估基于尸体的监测作为两栖动物健康监测补充工具的效用。
材料与方法
本研究在2022年4月至2025年6月期间，从德国石勒苏益格-荷尔斯泰因州各地机会性地收集了总计187只死亡的无尾两栖动物，代表了9个物种。志愿者使用标准化问卷记录收集坐标、日期和环境背景等元数据。尸体在-20°C冷冻储存，平均储存时间为72天。所有动物均按标准程序进行尸检，并评估其分解状态（1-5级，5级被排除研究）。采集皮肤、肝脏、肾脏和脑部（研究中后期开始采集）样本，用于病原体筛查和组织学检查。样本质量是后续分析的重要考虑因素，尤其是保存状况。
分子检测
皮肤、肝脏、肾脏和脑部样本通过实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测Bd、BfHV1、RaHV3和蛙病毒。DNA提取使用MagNA Pure 96系统完成。Bd检测靶向ITS区域，并使用GPL谱系特异性PCR进行确认。BfHV1和RaHV3的检测采用优化的TaqMan探针法。蛙病毒的检测靶向主要衣壳蛋白基因。所有检测均设置了阳性和阴性对照，Ct值小于35判为阳性，35-38为弱阳性。检测的灵敏度和检测限已在相应原始文献中报告。
组织学
在可能的情况下，采集腹侧和背侧皮肤、肝脏和肾脏的代表性样本，用4%中性福尔马林缓冲液固定，常规处理后进行石蜡包埋和切片（2μm），并进行苏木精-伊红（H&E）染色，在光学显微镜下检查。由于广泛液化，未收集脑组织样本进行组织学检查。只有保存状态允许详细评估皮肤层的样本才被纳入组织学评估。评估标准包括是否存在与BfHV1或RaHV3感染一致的病变（如核内包涵体、表皮增生、细胞间水肿、细胞内和核内空泡化，以及角化不全和角化不良），以及是否出现与Bd感染一致的病变（如表皮增生、角化过度和孢子囊的存在）。
统计分析
使用R软件进行统计分析。采用列联表分析评估病原体检测（BfHV1、RaHV3、Bd）与宿主或采样因素（包括物种、采集月份、储存时间、尸体来源、分解状态和性别）之间的关联。对于仅限于普通蟾蜍（Bufo bufo）的分析，则不包含物种因素。对原始p值进行了多重比较校正，校正后p值（FDR）≤0.05被视为有统计学意义。还计算了组织特异性病原体阳性率。
结果
物种组成与病原体检测
收集的物种包括普通蟾蜍（B. bufo, n=148）、普通青蛙（Rana temporaria, n=19）、水蛙（Pelophylax spp., n=8）、摩尔蛙（Rana arvalis, n=5）、纳特杰克蟾蜍（Epidalea calamita, n=3）、普通铲足蟾（Pelobates fuscus, n=2）和欧洲树蛙（Hyla arborea, n=2）。其中，只有普通蟾蜍和普通青蛙检测到至少一种病原体。
BfHV1仅在普通蟾蜍中检测到，阳性率为48.6%（72/148）。大多数阳性结果来自皮肤样本，在肾脏、肝脏和脑部样本中的检出频率较低。在BfHV1阳性的普通蟾蜍中，病毒最常在单一组织中检测到，其次是在两个组织中检测到。RaHV3主要在普通青蛙中检测到，阳性率为23.6%（4/19），并且在所有阳性个体中，病毒DNA仅在皮肤组织中被检测到。在一只普通蟾蜍中也检出了RaHV3。Bd仅在单一普通蟾蜍的皮肤样本中检测到，并被鉴定为全球流行谱系（GPL）。蛙病毒在任何样本中均未检出。
分解状态、性别与路杀关联
大多数样本的分解状态被评为3级（35.6%）或4级（32.4%）。性别在146只动物中得以确定。路杀是主要的死亡原因，尤其是在普通蟾蜍中，高达89.9%的个体被怀疑为路杀。
与病原体检测的相关性
统计显示，在包含所有物种的全数据集中，病原体检测（BfHV1和RaHV3）与路杀状态、物种和采集月份显著相关，其中感染率在三月达到峰值。然而，只有普通蟾蜍对BfHV1和Bd呈阳性，其他物种均为阴性，且非蟾蜍物种的样本量非常小。当分析仅限于普通蟾蜍时，路杀与病原体检测之间的正相关不再显著，而采样月份的影响依然存在。经过多重检验校正后，未观察到病原体检测与分解状态、储存时间或性别之间存在显著关联。采样地点也与BfHV1的检出状态显著相关。采样点在地理分布上存在差异，部分地点贡献了大量尸体，而另一些地点仅有个体样本。
组织学评估
皮肤的组织学评估因样本降解和频繁出现的伪影（如切片伪影和表皮浅层部分缺失）而受到明显限制。在排除低质量材料后，仅剩一部分样本可评估（腹侧皮肤：33%；背侧皮肤：53%）。偶尔观察到局灶性上皮增生，但这些变化无法与伪影可靠区分。未识别出任何指示所测病原体的病变，也未检测到PCR阳性与任何组织学变化之间的关联。
讨论
本研究证实了疱疹病毒在石勒苏益格-荷尔斯泰因州两栖动物中的高检出率。BfHV1在近半数的普通蟾蜍中检出，RaHV3在超过四分之一的普通青蛙中被识别。相比之下，Bd的检出率要低得多，而蛙病毒则完全未被检测到。鉴于采样是基于尸体和机会性的，这些数值应解释为所提交样本中的病原体检出率，而非真实的种群流行率。
普通蟾蜍中BfHV1的高检出率与德国活体动物中30-60%流行率的先前报告一致，证实了BfHV1在该国的广泛分布。三月检出率较高，这与产卵季节相吻合，可能反映了季节性驱动的宿主行为和免疫调节。尽管PCR阳性率很高，但未观察到典型的疱疹病毒感染（如核内包涵体）的肉眼或组织病理学病变。这一发现必须谨慎解释，因为大多数采样动物是路杀，皮肤撕裂和表皮上层脱落普遍存在，阻碍了详细的皮肤组织学评估。
环境条件，特别是温度，已知对疱疹病毒的复制动态有很强的影响。在鱼类疱疹病毒的研究中已证明，病毒复制、潜伏和疾病表现是温度依赖性的。本研究中未收集环境数据，因此无法评估环境因素如何影响病原体检测或感染动态。未来的研究应整合环境参数，包括植被、水质和气候数据，以实证评估它们在野生两栖动物种群中病毒激活和传播中的作用。
除了皮肤样本，BfHV1 DNA还在肝脏、肾脏和脑组织中被检测到。系统性感染先前已在BfHV1中被报道过。然而，本研究中所检查动物内部组织的严重自溶阻碍了包涵体或其他活动性感染指标的组织学确认。在多种组织中发现病毒DNA应谨慎解读，因为许多BfHV1阳性内部器官的个体是路杀，它们表现出广泛的创伤和器官脱出，这可能导致内部组织被皮肤材料或环境碎屑污染。未来基于尸体的研究应优先选择体腔完整的保存良好的标本，以最大限度地降低污染风险，并允许更准确的组织病理学评估，帮助评估BfHV1感染中多器官受累的可能性。
RaHV3主要在普通青蛙中检测到，仅在一只普通蟾蜍中呈阳性。检出率略低于先前在石勒苏益格-荷尔斯泰因州四个地点活体采样的报告。病毒DNA仅在皮肤样本中发现，这与当前认为RaHV3主要感染表皮组织的知识一致。本数据集不允许就宿主特异性或跨物种传播得出结论。我们的发现仅证实了BfHV1和RaHV3在同域分布的两栖动物物种中存在，而真实的宿主范围仍有待通过靶向实验或分子研究来阐明。
仅检测到一个Bd阳性个体，且未发现蛙病毒。然而，除了普通蟾蜍之外，其他物种的小样本量限制了对结果的广泛解释。普通蟾蜍样本中Bd的低检出率与已知的宿主特异性感染模式一致，因为普通蟾蜍对Bd的易感性往往较低。来自同一地区同期活体动物采样的数据显示了更高的Bd流行率，并支持了蛙病毒在德国北部不存在的结论。这些发现表明，基于尸体的监测可能低估了某些病原体的真实感染率，特别是那些宿主死亡率较低或在路杀样本中可检测性较低的病原体。
本研究中使用的样本收集时间跨度长，储存时间差异很大，长达400天。但我们的数据未显示PCR检测存在与储存相关的偏差。此外，在储存长达399天的两个样本中成功检测到RaHV3，这与先前证明DNA用于PCR分析的长期稳定性的研究相符。
本研究中的大多数标本是繁殖迁徙期间被路杀的动物，这导致样本强烈偏向于普通蟾蜍。这种采样策略妨碍了对种群水平流行率的可靠推断，并限制了在提交的尸体材料中对病原体检出的结论。这种采样偏差可能解释了病毒检测与物种、性别或路杀状态之间明显的关联，当控制样本量时，这些关联就消失了。因此，从当前数据集中无法得出关于物种特异性易感性的结论。已知雄性普通蟾蜍在繁殖迁徙期间不成比例地受到路杀影响，因此，基于尸体的数据集中的性别相关模式可能反映了收集偏差，而非真实的性别特异性易感性。由于湿地或森林栖息地的尸体很少被回收，路杀仍然是一个实用但有偏差的样本来源。
基于机会性收集尸体的被动监测可以为病原体存在和地理分布提供初步见解，特别是通过分子检测方法。然而，此类数据固有地受到样本降解、污染风险和强烈采样偏差的限制，因此不能取代主动监测，也不支持详细的病理学或种群水平推断。相反，基于尸体的监测应被视为一种补充性的、非侵入性的筛查方法，用于识别病原体的存在，并为有针对性的后续调查提供信息。
