《Pathogens》：Native Bacillus-Based Probiotic Consortia Suppress Vibrio parahaemolyticus and Restructure Hatchery Water Microbiomes in Shrimp Larval Systems
Betty Pazmi?o-Gomez,
Karen Rodas-Pazmi?o,
Rodrigo Pazmi?o-Pérez,
Tania Tapia-Guijarro,
Wilman Balcazar-Quimi,
Samuel Valle-Asan,
Salma Salazar-Vera,
Martin Villalva-Vera,
Deily Ochoa-Fajardo and
Edgar Rodas-Neira
1. 引言
两栖动物是目前全球受威胁最严重的脊椎动物类群，其灭绝速率估计高达背景水平的200倍。种群数量下降自20世纪中期以来持续发生，驱动因素多种多样，包括栖息地丧失、气候变化、入侵物种的引入和过度开发。传染病是导致两栖动物种群快速下降的最广泛报道原因之一。
在德国，几种主要的两栖动物病原体已有记载。壶菌真菌蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis, Bd）在德国广泛分布，局部流行率为3-8%。相比之下，Batrachochytrium salamandrivorans(Bsal) 已成为蝾螈数量下降的主要驱动因素，特别是在德国南部和西部，并且有证据表明其正在向邻近的北部地区传播。相比之下，蛙病毒在德国仅被零星检测到。
除了壶菌和蛙病毒，在无尾目动物中还描述了属于异疱疹病毒科（Alloherpesviridae）的几种疱疹病毒，包括蛙疱疹病毒和蟾蜍疱疹病毒。在德国，BfHV1和RaHV3是最常报道且具有临床相关性的两栖动物疱疹病毒，在自由生活的蟾蜍科和蛙科物种中已证实有感染，包括在石勒苏益格-荷尔斯泰因州，其基于活体动物采样的PCR检出率在常见蟾蜍中BfHV1高达60%，在常见蛙中RaHV3达44%。
尽管关于德国及邻近地区两栖动物病原体的研究日益增多，但关于其发生、共现及种群水平影响的系统性数据仍然有限，尤其是在德国北部。石勒苏益格-荷尔斯泰因州拥有丰富的两栖动物多样性，目前已知是15种两栖动物的原生分布区的一部分，但缺乏系统性的健康监测。基于死亡个体的非侵入性采样在此类背景下提供了一种有价值的方法，因为它允许在不进一步影响脆弱种群的情况下检测病原体。此外，对死亡动物的采样可以捕捉到在活体动物调查中经常被遗漏的晚期临床或病理学迹象。
本研究旨在通过对在石勒苏益格-荷尔斯泰因州全境机会性收集的死亡无尾目动物进行Bd、蛙病毒、BfHV1和RaHV3检测，以弥补这些知识空白。Bsal被排除在外，因为它主要影响有尾目动物。进一步的目标是评估基于死亡个体的监测作为两栖动物健康监测补充工具的效用，为检测野生种群中的感染提供一种非侵入性且经济高效的方法。
2. 材料与方法
2.1. 动物收集
在2022年4月至2025年6月期间，从德国石勒苏益格-荷尔斯泰因州各地机会性收集了总共187只死亡无尾目动物，代表9个物种，作为旨在建立两栖动物种群健康监测计划的研究项目的一部分。样本由志愿者提供，他们按照标准化问卷记录了元数据，包括采集坐标、日期和环境背景（例如，靠近道路或水体的距离）。尸体要么立即处理，要么在尸检前在-20°C下冷冻储存长达400天（平均储存时间：72天）。所有动物均按照标准方案进行尸检。尽可能对每只动物进行物种、性别和生命阶段的鉴定。根据Brooks描述的标准评估分解状态，总结如下：分解状态1（新鲜），特征是没有变色或昆虫活动。状态2（早期腐烂），显示轻微的灰色至绿色变色和皮肤滑脱；状态3（活跃腐烂），以多个器官变色为标志；状态4（晚期腐烂），伴有湿润的组织分解和肉质松弛；以及状态5（干燥/骨骼化），表现为木乃伊化和/或骨骼化。分解状态为5的动物被排除在研究之外。如果可用，则收集皮肤、肝脏、肾脏和大脑样本用于病原体筛查和组织学检查。在研究期间，根据采样方案的修改，仅在采样期结束时收集了部分动物的大脑样本。
2.2. 分子检测
通过PCR检测皮肤、肝脏、肾脏和大脑样本中的Bd、BfHV1、RaHV3和蛙病毒。在Laboklin公司进行分析。样品储存在-20°C至-70°C，并在隔热箱中用冷包运输。使用MagNA Pure 96系统和DNA及病毒核酸小体积试剂盒提取DNA，包括内部提取对照，以确认核酸分离成功并排除PCR抑制。
Bd检测通过靶向ITS区域的实时PCR进行，并额外使用针对全球大流行谱系（GPL）的谱系特异性PCR进行分析。BfHV1和RaHV3的检测采用源自Origgi的TaqMan实时PCR方法，引物和探针的退火温度优化为60°C。蛙病毒的分析通过靶向主要衣壳蛋白基因的实时PCR进行。
Bd的阳性对照来自经测序确认的临床样本，BfHV1的阳性对照来自B. bufo，RaHV3的阳性对照来自R. temporaria。蛙病毒的阳性对照是细胞培养中扩增的蛙病毒分离株。所有阳性对照的浓度均用PCR级水调整至测定特异性阈值循环数（Ct）值30-32。阴性对照为PCR级水。每个PCR板上都包含阳性和阴性对照。
所有实时PCR测定均使用商用TaqMan预混液，按照制造商的建议和原始出版物中规定的循环条件进行。当扩增发生在测试实验室经验证的诊断方案定义的Ct值范围内时，样本被视为阳性。所有PCR分析（包括阳性对照）中，Ct值小于35视为阳性，35-38视为弱阳性，大于38视为阴性。所有测定的分析灵敏度和检测限已在各自的原始出版物中报告。
2.3. 组织学
在可能的情况下，将具有代表性的腹侧和背侧皮肤、肝脏和肾脏样本在4%中性缓冲福尔马林中固定至少24小时，进行常规处理，石蜡包埋，并以2微米厚度切片。切片用苏木精和伊红染色，并在光学显微镜下检查。由于脑组织广泛液化，未收集脑样本用于组织学检查。
仅当样本保存状态允许对皮肤各层进行详细评估时，才将其纳入组织学评价。显示晚期分解迹象的样本被排除。排除标准包括表皮完整性丧失、细胞质和细胞核褪色、细胞细节丧失、明显空泡化，以及上皮细胞广泛区域出现核溶解、核碎裂和细胞质肿胀。
皮肤样本基于BfHV1或RaHV3感染的标准进行评估，包括是否存在核内包涵体、表皮增生、细胞间水肿（海绵状水肿）、细胞内外和核内空泡化以及角化不全和角化不良。也评估了与Bd感染一致的病变，如表皮增生、角化过度和游动孢子囊的存在。
2.4. 统计分析
在R中进行统计分析。通过列联表分析评估病原体检测与宿主或采样因素之间的关联。对于2×2表，应用Fisher精确检验；对于较大的表，使用卡方检验，在预期计数低的情况下使用Fisher精确检验作为后备方案。对于储存时间，使用Wilcoxon秩和检验比较连续数值储存时间与二元病原体存在。原始p值通过Benjamini-Hochberg方法进行多重比较校正，校正后的p值报告为FDR。校正后的p值小于等于0.05被视为显著。
计算条件比例以评估组织特异性病原体流行率，代表在至少一个器官检测呈阳性的个体中，每个组织内阳性结果的百分比。
使用R包sf、ggplot2和rnaturalearth可视化收集动物的空间分布。
3. 结果
3.1. 物种组成
本研究收集的物种包括B. bufo、R. temporaria、Pelophylaxspp.（水蛙）、Rana arvalis（沼蛙）、Epidalea calamita（纳特杰克蟾蜍）、Pelobates fuscus（普通锄足蟾）和Hyla arborea（欧洲树蛙）。
3.2. 病原体检测
只有两个物种——B. bufo和R. temporaria——对至少一种病原体检测呈阳性。
BfHV1仅在B. bufo中检测到。大多数阳性结果来自皮肤样本，而在肾脏、肝脏和大脑中的检测较少发生。在几乎所有阳性个体中，病毒都在皮肤中检测到，只有一只动物仅在肾脏组织中呈阳性。
在BfHV1阳性的B. bufo中，只有一部分拥有全部四种组织类型。在这些个体中，BfHV1最常在一个组织中检测到，其次是在两个组织中检测到，而更少的动物在两个以上组织中呈阳性。
当仅考虑皮肤、肾脏和肝脏时，观察到类似的模式，大多数动物在单一组织类型中呈阳性，其次是多组织检测。
RaHV3在R. temporaria和一只B. bufo中检测到。在所有阳性个体中，病毒DNA仅在皮肤组织中检测到。
Bd仅在一只B. bufo的皮肤中检测到。谱系特异性检测鉴定出BdGPL谱系。在任何样本中均未检测到蛙病毒。
3.3. 分解状态、性别和路杀
大多数标本被评定为分解状态3或4。分解状态1见于0.5%的个体，状态2见于28.7%的个体。在146只动物中可以确定性别，其中雄性86只，雌性60只；另有42只个体性别未确定。143例怀疑为路杀；其中雌性40例，雄性71例。路杀在B. bufo中尤其高，占收集个体的89.9%。
3.4. 与病原体检测的相关性
考虑到物种间采样不均，首先对包含所有两栖动物物种的完整数据集进行统计分析，然后仅限于B. bufo。在完整数据集中，病原体检测与路杀状态、物种和采样月份显著相关，流行率在三月达到峰值。然而，只有B. bufo对BfHV1和Bd检测呈阳性；所有其他物种均为阴性。此外，非蟾蜍物种的样本量非常小。当分析仅限于B. bufo时，路杀与病原体检测之间的正相关性不再显著，而采样月份的影响仍然存在，感染率在三月高于四月和五月。
经过多重检验校正后，未观察到与分解状态、储存时间或性别的显著关联。
采样地点与所有两栖动物和B. bufo内的BfHV1状态显著相关。然而，不同地点的采样工作不平衡，一些地点贡献了许多尸体，而其他地点仅贡献了个体。收集的B. bufo和R. temporaria及其感染状态的分布概览在图中展示。
3.5. 组织学
皮肤的组织学评估明显受到样本降解和频繁伪影的限制。在排除质量差的材料后，只有一部分样本可评估。观察到偶发的局灶性上皮增生；然而，这些变化无法与伪影可靠地区分开。未发现指示任何所测试病原体的病变，也未检测到PCR阳性与任何组织学变化之间的关联。
4. 讨论
本研究表明，在石勒苏益格-荷尔斯泰因州的两栖动物中，疱疹病毒感染检出率很高，BfHV1在近一半的B. bufo中检出，RaHV3在超过四分之一的R. temporaria中被鉴定。相比之下，Bd的检出率要低得多，而蛙病毒则完全未检测到。鉴于基于死亡个体、机会性采样的性质，这些数值应解释为提交样本中的病原体检出率，而非真实的种群流行率估计。
B. bufo中BfHV1的高检出率与先前德国活体动物中30-60%流行率的报道一致，证实了BfHV1在德国广泛分布。三月检出率更高，与产卵季节重合，可能反映了季节驱动的宿主行为和免疫调节，支持了早先关于两栖动物疱疹病毒感染季节性动态的发现。
尽管PCR阳性率高，但未观察到典型的疱疹病毒感染病变。这一发现必须谨慎解释，因为大多数采样的动物是路杀动物。在大多数动物中都发现了皮肤撕裂和表皮上层脱落，阻碍了皮肤的详细组织学评估。
总的来说，本研究中获得组织学数据未能识别出任何PCR阳性动物中与BfHV1、RaHV3或Bd相关的皮肤病变。
环境条件，特别是温度，已知对疱疹病毒复制动态有很强的影响。对鱼类疱疹病毒的研究表明，病毒复制、潜伏和疾病表现是温度依赖性的，在适合病毒复制的最佳热条件下常发生再激活。这些效应被认为是由于温度驱动了变温宿主的生理和免疫能力变化。
在本研究中，未收集环境数据，因此无法评估环境因素如何影响病原体检测或感染动态。未来的调查应整合环境参数，包括植被、水质和气候数据，以实证评估它们在野生两栖动物种群中病毒激活和传播的作用。
除了皮肤样本，BfHV1 DNA还在肝脏、肾脏和脑组织中检测到。先前已有关于BfHV1系统性感染的报告。本研究中检查的动物内部组织严重自溶，阻碍了包涵体或其他活动性感染指标的组织学确认。因此，对在各种组织中发现病毒DNA应谨慎解读。许多BfHV1阳性内部器官的个体是路杀动物。它们表现出广泛的创伤和器官突出，这可能导致内部组织被皮肤材料或环境碎片污染。未来基于死亡个体的研究应优先考虑体腔完好的保存良好的标本，以最大限度地降低污染风险，并允许更准确的组织病理学评估，有助于评估BfHV1感染中多器官受累的可能性。
RaHV3主要在R. temporaria中检测到，仅有一只B. bufo呈阳性。本研究样本中的检出率略低于先前在石勒苏益格-荷尔斯泰因州四个地点进行的活体采样报告。病毒DNA仅在皮肤样本中发现，这与当前认为RaHV3主要感染表皮组织的知识一致。与在多种组织中检测到BfHV1的B. bufo相比，所有检测到RaHV3的R. temporaria都不是路杀动物，且都是在尸体完整的情况下发现的死亡个体。因此，在这些动物中，内部组织污染的可能性远低于BfHV1阳性的B. bufo。
尽管偶尔有报道称蛙病毒在非典型宿主物种中被检测到，但本数据集无法得出关于宿主特异性或跨物种传播的结论。本发现仅证实了BfHV1和RaHV3在共域的两栖动物物种中均有发生，而真正的宿主范围仍有待通过靶向实验或分子研究来阐明。关于两栖动物异疱疹病毒严格宿主特异性的断言尚不成熟，且大多基于有限的证据。大多数关于宿主限制的现有数据来自鱼类异疱疹病毒。
仅检测到一只Bd阳性个体，且未发现蛙病毒。然而，B. bufo以外物种的小样本量限制了对结果的更广泛解释。本研究中蟾蜍样本的Bd检出率低，与已知的宿主特异性感染模式一致。来自同一地区同期活体动物采样的数据表明Bd流行率更高，并支持德国北部不存在蛙病毒。这些发现表明，基于死亡个体的监测可能低估了某些病原体的真实感染率，特别是那些宿主死亡率低或在路杀标本中可检测性低的病原体。
本研究中使用的样本是在较长时间内收集的。储存时间差异很大，最长可达400天。然而，本数据未表明PCR检测存在与储存相关的偏差。此外，成功检测到储存长达399天的两个样本中的RaHV3，这与先前证明DNA长期稳定用于PCR分析的研究结果一致。
本研究中的大多数标本是在繁殖迁徙期间收集的路杀动物，导致样本强烈偏向B. bufo。这种采样策略妨碍了对种群水平流行率的可靠推断，并限制了对所提交尸体材料中病原体检测的结论。这种采样偏差可能解释了病毒检测与物种、性别或路杀状态之间明显的关联，这些关联在控制样本量后消失。尽管在完整数据集中病原体检测与物种显著相关，但这种影响是由样本中B. bufo的主导地位以及其他物种中缺乏阳性病例驱动的。因此，无法从本数据集中得出关于物种特异性易感性的结论。已知雄性B. bufo在繁殖迁徙期间受路杀的影响尤为严重，因此，基于死亡个体数据集中与性别相关的模式可能反映的是收集偏差，而非真实的性别特异性易感性。由于湿地或森林栖息地的尸体因食腐动物活动和难以接近而很少被回收，路杀仍然是一个实用但有偏差的样本来源。
基于机会性收集的死亡个体进行的被动监测，特别是通过分子检测方法，可以提供关于病原体存在和地理分布的初步见解。然而，此类数据固有地受到样本降解、污染风险和强烈采样偏差的限制，因此不能替代主动监测，也不能支持详细的病理学或种群水平推断。相反，基于死亡个体的监测应被视为一种补充性的、非侵入性的筛查方法，用于识别病原体存在，并为有针对性的后续调查提供信息。
