《Horticulturae》：STARP Marker Development for Cadmium Accumulation Mutant Loci of the CaHMA1 Gene and Construction of a DNA Fingerprinting Map in Pepper (Capsicum annuum L.)
He Huang,
Chao Song,
Ali Raza,
Xiaodong Li,
Kun Lu,
Wei Zhang,
Nannan Li,
Yourong Chai,
Yu Pan and
Weihong Xu
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本研究开发了基于辣椒Cd2+富集关键基因CaHMA1内含子区SNP位点的三种高精度STARP分子标记，能快速、经济、准确地鉴定不同单倍型辣椒的果实镉积累能力。同时，通过筛选核心SNP位点，成功构建了集品种鉴别与镉积累性状评价双重功能于一体的辣椒DNA指纹图谱，为辣椒低镉积累性状的分子标记辅助选择（MAS）育种提供了有力的技术与工具支持。
引言：土壤镉污染与辣椒产业的挑战
镉（Cd）是一种全球性的农业土壤污染物，对植物生长、作物品质及人类健康构成严重威胁。研究表明，全球超过20%的农用地土壤镉含量超标。中国西南地区作为主要的辣椒产区，其独特的喀斯特地貌导致土壤镉本底值较高，使得当地辣椒及其产品镉超标风险显著。辣椒果实作为一种易富集镉的作物，其果实的镉积累问题日益突出。因此，选育低镉积累的辣椒品种，是从源头保障食品安全、推动辣椒产业可持续发展的最经济有效策略。分子标记辅助选择（MAS）育种凭借其高效、精准的优势，已成为培育低镉积累作物品种的主要方法之一。此前，一项全基因组关联分析（GWAS）鉴定出重金属转运ATP酶基因（CaHMA1）是调控辣椒果实镉积累的关键基因。其内含子区的三个单核苷酸多态性（SNP）位点与果实镉含量变异显著相关，并可将群体划分为不同单倍型（Hap），为进一步开发分子标记奠定了坚实基础。
材料与方法：从标记开发到图谱构建的系统性实验设计
本研究首先从215份重测序的辣椒种质中，根据栽培类型、遗传关系及CaHMA1单倍型，筛选出70份核心种质，用于后续分子标记的验证。这70份种质涵盖了所有栽培类型和已知的单倍型，具有良好的代表性。此外，还以216份辣椒种质（包括上述215份及参考基因组品种“遵辣1号”）为材料，用于构建DNA指纹图谱。
研究核心是开发针对CaHMA1基因内含子区三个关键SNP位点（Chr02_154361710, Chr02_154362005, Chr02_154367255）的半热不对称反转PCR（STARP）分子标记。STARP技术是一种新兴的SNP分型技术，与主流的竞争性等位基因特异性PCR（KASP）技术原理类似，但通过使用两个通用引物元件可调（PEA）引物，无需昂贵的专用检测试剂，并可利用常规凝胶电泳进行分型，显著降低了检测成本，并提高了特异性。每个STARP标记包含五种引物。研究采用盆栽实验模拟镉胁迫，测定不同单倍型辣椒果实的镉含量。同时，基于对215份辣椒种质的重测序数据，计算了次要等位基因频率（MAF）、多态性信息含量（PIC）、观测杂合度（OH）和遗传多样性（GD）等参数，并按照MAF>0.40, PIC>0.35, OH<0.6等标准，从150个核心SNP中进一步筛选，旨在获得能够完全区分216份种质的最小SNP组合，最终结合前述三个CaHMA1相关SNP，共同构建辣椒DNA指纹图谱。
结果：高精度标记与多功能图谱的成功验证
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STARP标记的开发与验证
成功设计了三个STARP标记（STARP1, STARP2, STARP3）。利用这70份已知基因型的核心种质进行验证，结果显示，每个STARP标记均能准确地将种质分为纯合参考基因型、纯合变异基因型和杂合基因型三类，表现出共显性特性。基因分型结果与原始重测序获得的SNP标记结果一致性超过95%，证明了STARP标记的高可靠性。
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基于STARP标记的单倍型分析与镉含量关联
基于这三个STARP标记，将70份核心种质划分为Hap1（三个标记均为纯合变异基因型，GG/AA/GG）、Hap2（三个标记均为杂合基因型）和Hap3（三个标记均为纯合参考基因型，AA/GG/CC）。在5 mg·kg-1镉胁迫下，Hap1型辣椒果实的平均镉含量为2.11 mg·kg-1，而Hap2型果实的平均镉含量为1.54 mg·kg-1，降低了27.01%，差异显著。这证实了基于STARP标记划分的不同单倍型，其果实镉积累能力存在显著差异。
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核心SNP的筛选与遗传特性分析
从重测序数据中筛选出的150个核心SNP，其MAF、PIC、OH、GD的平均值分别为0.40、0.36、0.52、0.48，表明这些SNP在供试辣椒种质中具有较高的多态性、杂合度和遗传多样性，是构建高质量DNA指纹图谱的理想候选标记。
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集成镉积累性状的DNA指纹图谱构建
利用软件从150个核心SNP中筛选出能够完全区分216份辣椒种质的最小组合，共24个SNP，它们均匀分布在辣椒的12条染色体上，且多位于基因附近区域。将这24个SNP与已转化为STARP标记的3个CaHMA1内含子区SNP结合，成功构建了包含27个SNP位点的辣椒DNA指纹图谱。该图谱对216份种质的鉴别效率达到100%。尤为重要的是，由于整合了与果实镉积累能力显著相关的CaHMA1基因位点，该图谱不仅可用于品种鉴定，还能同步区分不同种质的果实镉积累能力，具备双重功能。
讨论：标记与图谱的价值、优势与展望
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高可靠性STARP标记的育种价值
本研究开发的三种STARP标记，基于调控辣椒镉积累的关键基因CaHMA1，具有成本低、通量高、特异性强、操作简便等优点，与重测序SNP标记一致性高，能够准确区分不同单倍型及相应的镉积累能力。这为辣椒低镉积累种质资源的快速筛选和MAS育种提供了高效、实用的分子工具。
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集成功能性状的DNA指纹图谱的实用创新
相较于传统基于简单序列重复（SSR）标记的指纹图谱，基于SNP标记构建的图谱具有位点特异性更强、数量更丰富、检测通量更高等优势。本研究构建的图谱仅用27个SNP即实现100%的鉴别率，极大地节约了鉴定成本和工作量。其核心创新在于将品种鉴定标记与关键性状（镉积累）功能标记有机结合，使图谱兼具“身份证”和“体检表”功能，在品种保护、真实性鉴定以及低镉性状定向筛选中具有很高的实用价值。
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机制探讨与未来方向
研究表明，CaHMA1基因内含子区的SNP变异可能导致基因表达水平或功能的改变，进而影响辣椒果实的镉积累能力。未来需进一步验证该基因内含子变异调控镉积累的具体分子机制。此外，本研究构建的指纹图谱和STARP标记的实用效率，有待在更大规模的育种群体和生产实践中进一步验证和优化。收集更多稀有的Hap3型种质进行补充分析，也将使研究结论更加完善。鉴于镉吸收转运机制在不同植物间的保守性，CaHMA1基因及相关标记在番茄等其他茄科作物的遗传改良中同样具有应用潜力。
结论
综上所述，本研究成功开发了基于CaHMA1基因的三种高精度STARP分子标记，可用于快速、准确地鉴定辣椒种质的果实镉积累能力，为辣椒低镉积累的MAS育种提供了有效工具。同时，构建了一个集成品种鉴定与镉积累性状评价双重功能的辣椒DNA指纹图谱，该图谱鉴别效率高，实用性强。研究成果为辣椒的遗传改良、品种保护及安全生产提供了重要的技术支撑和理论平台。
