基于双鳞片外植体的普罗菲斯苋无菌高效繁殖体系的建立及其遗传保真度评估

《Horticulturae》：In Vitro Propagation System for Proiphys amboinensis Using Twin-Scale Explants and Genetic Fidelity Assessment Kornkanok Chamchusri, Piyanuch Sornchai, Pitchaporn Wannitikul, Panumart Rithichai and Yaowapha Jirakiattikul

本研究为极具商业和药用潜力的观赏植物普罗菲斯苋（Proiphys amboinensis），建立了一套基于双鳞片外植体（twin-scale）的体外高效增殖（micropropagation）与遗传保真评估的综合技术方案。通过优化细胞分裂素N6-BA浓度、蔗糖水平和生长素IBA/NAA配比，成功诱导了体细胞胚（bulblet），促进了其生长与生根，并经炼苗后获得高存活率植株。研究同时运用简单序列重复间区（ISSR）分子标记和流式细胞术证实了再生植株的遗传稳定性。该工作为解决其商业化繁殖瓶颈提供了可靠的、遗传背景一致的无性繁殖技术，为其园艺应用和进一步药理学研究奠定了技术基础。

　　

引言

普罗菲斯苋（Proiphys amboinensis，亦称Eurycles amboinense）是一种隶属于石蒜科（Amaryllidaceae）的球根植物，在东南亚和澳大利亚北部地区有自然分布。作为一种极具潜力的观赏植物，其具有吸引人的叶片、独特的花序和长花期。更重要的是，其叶片在传统医学中被用于治疗疟疾，而鳞茎中含有的石蒜碱（lycorine）显示出乙酰胆碱酯酶抑制活性，在阿尔茨海默病的潜在治疗中颇具前景。然而，传统的种子繁殖因其高遗传变异性和低活力而受限，分株繁殖效率低下且周期长，这使其商业开发面临瓶颈。植物组织培养技术为快速、大量生产遗传一致的优质种苗提供了有效途径。在石蒜科植物中，双鳞片（即两片相邻鳞片附带部分基盘）是诱导不定胚（adventitious bulblet）形成的理想外植体。本研究旨在为该物种建立一套高效的、遗传保真的体外繁殖体系。

材料与方法

培养基与培养条件

实验统一采用Murashige and Skoog (MS)基本培养基，并根据各阶段实验添加不同浓度的植物生长调节剂和蔗糖。培养基用琼脂固化，pH调至5.6-5.8，于121°C高压灭菌。培养条件为25 ± 2°C，16小时光周期，光照强度约为45–55 μmol/m²/s PPFD。所有外植体在实验前均在不含植物生长调节剂的MS培养基上预培养2周。

植物材料与灭菌

供试球茎于2023年10月取自泰国清迈省。经过彻底清洗、分割后，采用70%乙醇初步处理，继而用四环素溶液超声处理，最后通过两步次氯酸钠（NaOCl）法进行表面灭菌，以获得无菌的双鳞片外植体。

BA浓度对体外体细胞胚诱导的影响

将无菌外植体接种于添加30 g/L蔗糖及不同浓度（0, 0.5, 1.0, 2.0 mg/L）N⁶-BA的MS培养基上，培养12周。记录体细胞胚形成效率、数量及平均鲜重。体细胞胚形成效率（%）=（形成体细胞胚的外植体数 / 接种外植体总数）× 100。

蔗糖浓度对体外体细胞胚生长和膨大的影响

将再生体细胞胚转移到含不同浓度蔗糖（30, 45, 60, 90 g/L）的MS培养基上培养6周，测量培养前后体细胞胚的鲜重和直径变化。

IBA和NAA浓度对体细胞胚生根诱导与驯化的影响

将再生体细胞胚接种于含30 g/L蔗糖及不同浓度（0.5, 1.0 mg/L）IBA或NAA的MS培养基上，以不添加生长素的培养基为对照，培养4周。记录生根率、根数和根长。生根率（%）=（生根的体细胞胚数 / 接种体细胞胚总数）× 100。生根后的体细胞胚经清洗，移栽至湿润椰糠中，在保湿条件下驯化两周后逐步适应外界环境，并计算存活率。存活率（%）=（存活的驯化植株数 / 移栽植株总数）× 100。

遗传保真度评估

利用Inter Simple Sequence Repeat (ISSR)分子标记对再生植株和母株进行DNA指纹图谱分析。同时，采用流式细胞术测定并比较再生植株与母株的基因组大小，以评估其遗传稳定性。

结果

BA浓度对体细胞胚诱导的影响

在0.5至2.0 mg/L BA的所有处理中，体细胞胚形成效率介于60.00 ± 16.33% 至 70.00 ± 11.55%之间，各处理间无显著差异。然而，在1.0 mg/L BA处理下，每个外植体产生的体细胞胚数量显著高于对照和0.5 mg/L BA处理。各处理间体细胞胚的平均鲜重无显著差异。

蔗糖浓度对体细胞胚生长和膨大的影响

蔗糖浓度在30至90 g/L范围内，对培养6周后的体细胞胚鲜重和直径均无显著影响。

IBA和NAA浓度对生根诱导与驯化的影响

在促进生根方面，0.5 mg/L IBA被证明是最佳处理。经驯化后，再生植株表现出极高的存活率（90–100%）。

遗传保真度评估

ISSR分析结果显示，所有检测的再生植株与母株的DNA条带模式完全一致，未检测到遗传变异。流式细胞术分析进一步证实，再生植株与母株的基因组大小保持一致。这两项分析共同表明，通过该体系再生的普罗菲斯苋植株具有高度的遗传保真度。

结论

本研究成功建立了一套适用于普罗菲斯苋的体外高效繁殖方案。该方案以双鳞片为外植体，在含1.0 mg/L BA的MS培养基上可有效诱导体细胞胚，蔗糖浓度在30-90 g/L范围内对其生长影响不显著，0.5 mg/L IBA是促进生根的最佳选择。最关键的是，通过ISSR标记和流式细胞术证实，再生植株保持了高度的遗传一致性。该体系为普罗菲斯苋作为商业观赏作物的规模化、标准化生产，以及未来针对其花卉生理、采后管理和药用成分的深入研究，提供了可靠且高效的种苗繁育技术平台。