《Horticulturae》：Identification and Characterization of WRKY Genes in Amaranthus palmeri and Their Response to Abiotic Stress
Xusi Liu,
Youning Wang,
Guoping Zhu,
Daniel Bimpong,
Wang Chen,
Yan Li and
Dongfang Ma
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这篇研究型论文首次在入侵性杂草长芒苋（Amaranthus palmeri）中完成了WRKY转录因子（TF）家族的系统鉴定。研究通过生物信息学和基因表达分析，揭示了32个ApWRKY基因的序列特征、进化关系及其在草铵膦铵、NaCl和PEG诱导的渗透胁迫下的差异表达模式。文章证实了ApWRKY2和ApWRKY5的核定位，并通过瞬时过表达实验，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中初步探索了ApWRKY1/2/5对叶绿素荧光和光合效率的潜在调控作用。该研究填补了长芒苋WRKY家族功能研究的空白，为理解其抗逆机制、开发新型杂草治理策略及作物抗逆育种提供了重要的理论基础。
绪论：WRKY转录因子与长芒苋的胁迫响应
WRKY是一类植物特有的转录因子，其结构包含一个高度保守的WRKYGQK结构域和一个锌指结构域，能够特异性结合靶基因启动子区的W-box顺式作用元件，从而精细调控植物对环境胁迫的响应。长芒苋是一种原产于北美西南部及墨西哥西北部的入侵性一年生杂草，因其萌发期长、生长迅速，并与主要作物争夺资源，可造成严重减产，对园艺系统构成重大威胁。目前，针对长芒苋胁迫响应的遗传调控基础，特别是WRKY家族的功能仍不清楚。本研究旨在对长芒苋WRKY家族进行全面基因组学鉴定，并分析其在草铵膦铵、盐和PEG6000诱导的渗透胁迫下的表达特征，以期为理解其适应机制和制定管理策略奠定基础。
材料与方法：从鉴定到功能验证
研究采用了综合的生物信息学与实验生物学方法。首先，从Comparative Genomics Research数据库获取长芒苋基因组数据，利用WRKY结构域的隐马尔可夫模型进行搜索，并结合拟南芥、小麦和番茄WRKY蛋白序列的BLASTP比对，在长芒苋中鉴定出32个具有完整保守结构域的ApWRKY基因。随后，通过TBtools等工具分析了其理化性质、基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件、系统进化、染色体定位和基因复制事件。利用STRING数据库和psRNATarget工具分别预测了蛋白-蛋白相互作用网络和潜在miRNA靶向调控关系。亚细胞定位通过Plant-mPLoc预测，并在本氏烟中通过瞬时表达ApWRKY2-GFP和ApWRKY5-GFP融合蛋白进行了验证。基因表达分析方面，选取长芒苋五叶期幼苗，分别用草铵膦铵、NaCl和PEG6000处理，在不同时间点取样，通过qPCR检测了6个随机选择的ApWRKY基因的表达动态。最后，将ApWRKY1/2/5-GFP融合构建体瞬时转化到拟南芥中，经草铵膦铵处理后，评估其对叶绿素荧光和含量的影响。
结果解析：ApWRKY家族的多维特征与胁迫响应
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ApWRKY基因家族的鉴定与基本特征：最终鉴定出32个ApWRKY基因，编码的蛋白长度、分子量、等电点等理化性质各异。所有ApWRKY蛋白均预测为不稳定且为亲水性，这与大多数WRKY蛋白的动态调控特性相符。亚细胞定位预测显示其均定位于细胞核，瞬时表达实验成功验证了ApWRKY2和ApWRKY5的核定位，支持其作为转录调控因子的功能。
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基因结构、进化与基因组分布：基因结构分析显示，ApWRKY基因的外显子-内含子组织存在变异，不含注释的UTR区域。保守基序分析鉴定出15个基序，其中基序1、2、3最为广泛保守。系统发育树将ApWRKYs与拟南芥、小麦及其他苋属物种的WRKY蛋白一同划分为I、II、III三个亚家族，其中10个属于I亚家族，18个属于II亚家族，4个属于III亚家族。这表明其进化关系与已知的WRKY分类一致。染色体定位显示32个ApWRKY基因不均匀地分布在15条基因组scaffold上，其中scaffold 3和8各含4个基因。共鉴定出7对片段复制基因对，其Ka/Ks比值均小于1，表明这些基因在复制后主要经历了纯化选择。估算的复制事件发生时间平均约为96.6百万年前，暗示古老的复制事件可能促进了该家族的扩张。
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相互作用网络与调控潜力：蛋白-蛋白相互作用网络预测分析显示，与ApWRKYs同源的19个拟南芥WRKY蛋白参与其中，其功能富集于对水杨酸响应、序列特异性DNA结合等过程。miRNA靶向预测分析发现，93个预测的miRNA可能靶向7个ApWRKY基因，其中ApWRKY1被最多（47个）miRNA预测靶向，表明ApWRKYs可能受到广泛的转录后调控。
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胁迫下的差异表达模式：qPCR分析揭示了ApWRKY基因对不同胁迫的复杂响应模式。在草铵膦铵处理下，ApWRKY5、ApWRKY7和ApWRKY24持续上调；ApWRKY2和ApWRKY21则持续下调。在PEG6000诱导的渗透胁迫下，ApWRKY21在所有时间点均上调，而ApWRKY2持续下调。在NaCl处理下，除ApWRKY21在12小时后被诱导并维持上调外，大多数基因表达下调。这些结果说明不同的ApWRKY成员可能在胁迫响应的不同阶段扮演着激活或抑制的特定角色。
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ApWRKY对光合作用的潜在调控：在拟南芥中瞬时过表达ApWRKY1/2/5并施加草铵膦铵后，与对照和仅用草铵膦处理的野生型拟南芥相比，ApWRKY过表达植株的叶绿素荧光强度和叶绿素a、b及总叶绿素含量均显著降低。这一发现暗示ApWRKYs可能通过负向调控光合作用相关过程，影响植物在除草剂胁迫下的光化学效率和生存能力。
讨论与结论：意义与展望
本研究首次在入侵性杂草长芒苋中系统鉴定了WRKY转录因子家族，并初步揭示了其在多种非生物胁迫下的表达规律和潜在功能。ApWRKYs在基因结构、系统进化上的特征与其他植物中的WRKY家族具有保守性，同时也通过片段复制和分化获得了多样性。其启动子区富含多种胁迫响应相关的顺式作用元件，为响应复杂环境信号提供了基础。表达谱分析表明，不同ApWRKY成员在草铵膦、盐和渗透胁迫下表现出特异性甚至相反的调控模式，提示它们构成了一个精细的胁迫响应调控网络。特别值得注意的是，在异源系统中，ApWRKY1/2/5的过表达降低了拟南芥在草铵膦处理下的叶绿素含量和荧光效率，这与已知的一些WRKY因子在胁迫下抑制光合作用基因表达、加速叶绿素降解的报道相一致，为理解长芒苋对抗除草剂的分子机制提供了新线索。
综上所述，该研究不仅填补了长芒苋这一重要农业杂草中WRKY转录因子家族研究的空白，所鉴定的ApWRKY基因为后续深入的功能研究（如基因编辑、稳定转基因验证）提供了靶点。研究成果对于解析长芒苋强大的环境适应性与入侵性机制、开发基于关键调控基因的新型杂草防控策略，以及利用同源基因改良园艺作物的非生物胁迫抗性，均具有重要的理论和应用价值。未来的研究需要在本氏烟或拟南芥的异源表达系统之外，进一步在长芒苋原生体系中验证这些基因的具体功能，并阐明其下游调控通路，以全面揭示WRKY介导的长芒苋胁迫适应网络。
