大豆C3H型锌指转录因子基因的全基因组鉴定、表征及其在盐和镉胁迫条件下的表达分析 中文标题 大豆C3H型锌指转录因子家族的全基因组解析及其在盐镉胁迫应答中的调控作用

《Current Issues in Molecular Biology》：Genome-Wide Identification and Characterization of C3H-ZFP Genes and Their Expression Under Salt and Cadmium Stress Conditions in Soybean Intikhab Alam, Khadija Batool, Hui-Cong Wang and Fang Qiao

本文通过全基因组水平鉴定与系统分析，揭示了大豆中140个C3H-ZFP基因的进化、结构与表达模式。研究发现多个GmC3H基因在盐(NaCl)和镉(Cd)胁迫下显著上调，并受MYB、AP2/ERF等转录因子及miR156/395/396等microRNA的广泛调控。该研究为利用C3H-ZFPs改良大豆非生物胁迫耐受性提供了重要候选基因与理论基础。

　　

1. 引言

锌指蛋白(ZFPs)是植物中最大且功能最多样的转录因子家族之一，根据半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)残基的数量、组织方式及间距，主要分为C2C2、C2H2、C3H等10种主要类型。其中，C3H型锌指蛋白(C3H-ZFP)由三个半胱氨酸和一个组氨酸残基(C₃H)与一个锌离子配位，形成特征性结构基序，其共识序列最初描述为C-X_6–14-C-X_4–5-C-X₃-H，后续研究扩展为C-X_4–17-C-X_4–6-C-X₃-H。C3H-ZFPs通过与核酸(DNA/RNA)相互作用，参与转录调控、RNA代谢、激素信号传导、免疫应答及环境适应等多种生理过程。研究表明，拟南芥(AtC3H17, AtC3H29, AtC3H47, AtC3H49)等物种中的C3H-ZFPs在盐、旱等非生物胁迫耐受性中发挥关键作用。然而，尽管C3H基因家族在多种模式及作物植物中已有广泛研究，但在全球重要的植物蛋白和油脂来源作物——大豆(Glycine max)中，其系统性鉴定、结构表征及功能分析仍较为有限。本研究旨在填补这一空白，对大豆C3H基因进行系统性鉴定与分析，以深入理解其基因组组织、进化关系及在胁迫响应中的潜在作用。

2. 材料与方法

研究使用大豆品种Williams 82。为探究GmC3H-ZFP基因在镉(Cd)和盐(NaCl)胁迫响应中的潜在作用，用0.05 mM Cd (CdCl₂)和250 mM NaCl处理7天龄大豆幼苗，并于处理后0(对照)、1、3、6小时收集根组织样本，通过qRT-PCR分析基因表达动态。通过BLASTp比对、HMM谱分析、SMART和InterProScan数据库确认，从大豆基因组中鉴定出C3H-ZFP同源序列。利用MEGA7软件基于最大似然法(ML)构建系统发育树。从Phytozome数据库提取启动子区序列，利用PlantCARE数据库进行顺式作用元件分析。通过psRNATarget服务器预测靶向C3H-ZFP基因的miRNA。利用TBtools软件将基因定位到染色体上，并进行复制事件分析，通过计算非同义(Ka)与同义(Ks)替换率比值评估选择压力。使用PAML软件包进行Ka/Ks分析。所有数据均以三次生物学重复的平均值±标准差(SD)表示，采用单因素方差分析和Duncan多重比较检验进行统计学分析(p < 0.05)。

3. 结果

3.1. 大豆C3H-ZFPs的鉴定与分类

研究在大豆基因组中鉴定出140个非冗余的C3H-ZFP基因，命名为GmC3H01至GmC3H140。这个数量远超拟南芥(68个)、水稻(67个)和蒺藜苜蓿(34个)。在140个推定蛋白中共鉴定出333个C3H结构域。每个GmC3H蛋白含有1至6个C3H结构域，其中37个含1个，58个含2个，19个含3个，7个含4个，17个含5个，2个含6个。根据基序“C-X_4–17-C-X_4–6-C-X₃-H”中特定保守氨基酸序列的变异和金属配体间间距的差异，这些结构域被进一步分为14个C3H-ZFP亚组。蛋白理化性质分析显示，其氨基酸长度范围为127-2020个残基，分子量在14.47至223.38 kDa之间，理论等电点(pI)在4.35至9.88之间。基因本体(GO)分析表明，大多数GmC3H基因与金属离子结合功能相关，主要定位于细胞核，涉及广泛的细胞和生物过程。

3.2. 大豆C3H-ZFP基因的系统发育分析

基于大豆、拟南芥、水稻和蒺藜苜蓿的C3H基因序列构建最大似然系统发育树，将GmC3H-ZFP基因分为10个主要组别(A–J)。其中F组包含基因最多(26个)，其次是C组(23个)，J组20个，E和I组各15个，A和B组各14个，H组5个，D和G组各4个。分析进一步揭示了所研究物种间C3H-ZFPs的高度进化保守性及直系同源关系。对基因结构的分析表明，亲缘关系较近的成员通常聚集在一起，并表现出高度相似的外显子-内含子结构组织。

3.3. 染色体分布与基因复制

140个大豆C3H-ZFP基因中有139个(99.28%)成功定位到20条染色体上，其余1个位于未锚定的支架上。这些基因在染色体上呈不均匀分布，Chr15上最多(21个)，Chr14有10个，Chr02、Chr08和Chr12各有9个，而Chr1和Chr16上的基因最少。复制分析显示，其中86个基因存在复制事件，包括8对串联重复和78对片段重复。对所有重复的GmC3H-ZFP基因对的Ka/Ks比率分析显示，所有基因对的Ka/Ks比值均小于1，表明这些基因在复制后及后续物种进化过程中经历了强烈的纯化选择。

3.4. C3H锌指结构域外其他结构基序的特征

对140个大豆C3H-ZFP全长蛋白序列进行分析，鉴定出除C3H基序外的23个不同结构域。根据这些附加结构域的存在与否及其结构关联，将这些蛋白分为16个主要组和亚组。第一大类由48个成员(34.28%)组成，其特征是仅存在C3H结构域，未观察到任何附加结构域。另一大类包含27个成员(19.28%)，进一步细分为6个亚组，每个亚组除C3H结构域外还含有RRM结构域。其余14个组包含1到18个成员，含有一个到三个额外的已知结构域，预计介导多种分子功能，如蛋白质-蛋白质相互作用(ANK, coiled-coil, RRM, JmjC, DFRP_C)、蛋白质结合(RING WD40 x 6, SET, PUG, CactinC_cactus, UBX)、核酸结合(KH, G_patch, DEXDc, HELICc, PRVT_3)、锌离子结合(RING, Zf-U1)等。

3.5. GmC3H-ZFP基因启动子区域分析

对GmC3H基因上游2 kb序列进行分析，共发现4785个潜在的顺式调控元件，并将其分为四大类：胁迫响应元件(39.10%)、光响应元件(37.36%)、植物激素响应元件(18.55%)以及与植物生长发育相关的元件(4.97%)。在鉴定出的顺式作用元件中，三个关键的光响应元件(Box-4, G-box, GT1-motif)、四个与脱落酸、茉莉酸甲酯、生长素和赤霉素信号传导相关的植物激素响应元件(ABRE, CGTCA, TGACG, P-box)、四个发育相关元件(O2-site, CAT-box, AT-rich, GCN4 motif)以及环境胁迫相关元件(ARE, MYB, MYC motif)频繁出现。

3.6. GmC3H-ZFP基因在不同组织中的空间表达模式

基于Phytozome数据库的公开数据，分析了140个GmC3H基因在种子、根、茎、叶等多种大豆器官和组织中的表达谱。所有GmC3H基因根据其表达谱被分为13个不同的组别(A–M)。A组包含2个主要在种子组织中表达的GmC3H基因。C组包含7个在花和叶中表达显著的基因，D组包含2个在茎中特异性表达的基因。F组包含4个在种子、茎尖分生组织(SAM)、豆荚和茎组织等多个组织中均有明显表达的基因。H组包含2个在豆荚和茎组织中均有显著表达的基因。K组包含3个在花、豆荚和种子中表达突出的基因，L组包含4个主要在叶中表达的基因。J组和M组包含19个在所有检测组织中均持续高表达的基因。相比之下，I组和G组包含在所有组织中表达中等的基因。B组(16个基因)和E组(17个基因)包含的成员在所有检测组织中表达极弱或不表达。

3.7. C3H-ZFP基因在盐和镉胁迫下的表达谱

为探究GmC3H-ZFP基因在非生物胁迫响应中的潜在作用，通过qRT-PCR检测了10个代表性GmC3H-ZFP家族成员在盐(NaCl)和镉(Cd)处理下大豆幼苗中的表达动态。在盐胁迫下，与对照相比，所有10个GmC3H基因在所有检测时间点均表现出差异表达。其中7个基因(GmC3H1, GmC3H39, GmC3H61, GmC3H63, GmC3H124, GmC3H127, GmC3H128)在盐胁迫暴露不同时间后上调。此外，GmC3H45和GmC3H65在盐胁迫下所有检测时间点(1、3、6小时)均持续下调，而GmC3H39、GmC3H85和GmC3H124在处理后1和3小时特异性下调。在镉胁迫响应中，5个GmC3H基因(GmC3H1, GmC3H63, GmC3H85, GmC3H124, GmC3H127)表现出显著上调。相比之下，两个基因(GmC3H61和GmC3H65)在镉暴露后1、3、6小时相对于对照持续下调。同样，GmC3H45在处理后1和3小时下调，GmC3H39在1和6小时下调，GmC3H128在3和6小时后下调。

3.8. 预测的miRNA及其靶向C3H-ZFP基因的分析

通过生物信息学分析，共鉴定出388个属于196个不同基因家族的miRNA，它们被预测靶向140个C3H-ZFP基因的潜在调控因子。值得注意的是，预测靶向C3H-ZFP基因的最富集microRNA通过互作网络可视化，突出了它们潜在的调控关联。分析显示，20个C3H-ZFP基因最频繁地被来自miR156家族的14个gma-miRNA靶向。此外，11个C3H-ZFP基因被鉴定为来自miR395家族的13个gma-miRNA的靶标。另外，11个基因被来自miR396家族的10个gma-miRNA靶向。

3.9. C3H-ZFP基因及其关联转录因子的调控网络

全面的生物信息学分析揭示，预测有37个不同的转录因子家族与140个C3H-ZFP基因相关。结果表明，87个GmC3H成员被MYB转录因子靶向，丰度最高，其次是AP2(60个GmC3H成员)、MIKC_MADS(60个GmC3H成员)、BBR-BPC(50个GmC3H成员)、ERF(46个GmC3H成员)、C2H2(46个GmC3H成员)、Dof(44个GmC3H成员)、TALE(33个GmC3H成员)、NAC(31个GmC3H成员)、bHLH(27个GmC3H成员)和bZIP(17个GmC3H成员)。

4. 讨论

C3H-ZF基因是跨多个物种广泛保守的调控因子，通过与DNA、RNA和蛋白质相互作用，在植物发育和胁迫响应中发挥关键作用。本研究旨在对大豆C3H-ZFP基因家族进行全面分析，并结合模式植物拟南芥C3H-ZFP基因的比较研究。研究结果阐明了C3H-ZFP基因家族的进化谱系，并强调了大豆C3H-ZFP基因的功能多样化。研究发现大豆C3H-ZFPs中存在14种不同的C3H基序亚组。与拟南芥相比，大豆中缺少C-X₄-C-X₅-C-X₃-H和C-X₇-C-X₆-C-X₃-H基序。相反，在大豆中鉴定出几种新的基序，包括C-X₄-C-X₄-C-X₃-H、C-X₆-C-X₅-C-X₃-H、C-X₁₇-C-X₆-C-X₃-H、C-X₇-C-X₅-F-X₃-H和G-X₄-C-X₆-C-X₃-H。这表明C3H-ZF基因家族内存在谱系特异性多样化。

染色体分布分析表明，C3H-ZFP基因的扩展主要由片段重复驱动；78对C3H-ZFP基因与片段重复事件相关，而8对与串联重复相关。这种不平衡表明，大规模的染色体重排，而非局部的串联扩增，是形成GmC3H-ZFP基因集的主要力量。Ka/Ks分析表明所有重复的C3H-ZFP基因对都经历了强烈的纯化选择，暗示它们的功能重要性及维持其完整性的选择压力。

启动子分析揭示了与植物激素信号传导(ABRE, CGTCA-motif, TGACG-motif, P-box)、光响应(Box-4, G-box, GT1-motif)、发育过程(O2-site, CAT-box, AT-rich, GCN4 motif)以及胁迫响应(ARE, MYB, MYC-motif)相关的多种顺式作用元件。这表明C3H-ZFP基因的表达可能受激素和环境胁迫信号的影响。

鉴定出388个来自196个家族的miRNA靶向140个C3H-ZFP基因，表明该基因家族存在广泛的转录后调控。特别是，miR156、miR395和miR396家族的成员靶向多个关键的C3H-ZFP基因。考虑到它们在种子大小调控中的已知作用，这提示C3H-ZFPs可能对种子发育和产量相关性状有贡献。在预测的C3H-ZFP调控网络中，MYB转录因子是最丰富的TF家族，AP2 TF是其次丰富的组。AP2/ERF家族成员参与植物生长、发育和胁迫响应通路的各个方面。此外，还涉及MIKC_MADS、BBR-BPC、ERF、C2H2、Dof、TALE、NAC、bHLH和bZIP等多种TF。

表达谱分析显示，140个大豆C3H-ZFP基因中有107个(76.42%)在至少一种组织中表达。其中约三分之一在所有组织中持续高表达，约三分之一在一到三种组织中呈现组织偏好性表达，而剩余三分之一在所有组织中表达水平较低。这些发现表明大豆C3H-ZFP基因家族可能存在功能多样化。许多表现出组织特异性表达模式的成员是未来功能表征的有希望的候选基因，并可能在油料作物的遗传改良中具有潜在应用价值。

5. 结论

本研究系统鉴定并分析了大豆中的140个C3H-ZFP基因，探究了它们的系统发育关系、保守的GmC3H-ZFP结构域和染色体分布。系统发育分析将GmC3H-ZFP基因分为10个主要进化枝，这通常得到保守基