表没食子儿茶素-3-没食子酸酯可减轻氟苯尼考的免疫毒性，并增强Procambarus clarkii的先天免疫力

《Aquatic Toxicology》：Epigallocatechin-3-gallate attenuates immunotoxicity of florfenicol and enhances innate immunity in Procambarus clarkii

氟苯尼考（FF）通过抑制UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGT）和细胞色素P450（CYP450）活性引发 crayfish 免疫毒性，而表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）可逆转FF导致的免疫抑制，通过增强超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和溶菌酶（LZM）活性，促进Hsp70、caspase3等基因表达恢复，病理学分析证实EGCG减轻了肝胰组织损伤。

　　

赵玉杰|李一琳|朱飞

浙江省绿色生态健康畜牧业应用技术重点实验室，浙江农林大学动物科学与技术学院，兽医学院，杭州311300，中国

摘要

氟苯尼考（FF）是一种用于兽医领域的抗菌剂，其在牲畜体内的残留物与免疫毒性效应有关。本研究探讨了表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）减弱氟苯尼考对Procambarus clarkii免疫毒性的潜力。实验结果表明，给予EGCG（1 mg/mL）可增加总血细胞计数，表明其增强了免疫反应。通过使用检测试剂盒，数据表明EGCG降低了UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGT）和细胞色素P450（CYP450）的活性，这两种酶在氟苯尼考暴露后与细胞损伤有关。此外，EGCG还增强了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和溶菌酶（LZM）的活性，这些酶具有抗菌和抗氧化功能，但在氟苯尼考作用下会减弱。肝胰腺的组织病理学分析证实EGCG减轻了氟苯尼考引起的组织损伤。在分子水平上，EGCG使参与氟苯尼考诱导的免疫反应的基因（如Hsp70、caspase3、Crustin、IMD）的表达水平恢复到基线水平。总之，EGCG能够降低水生经济动物的氟苯尼考免疫毒性，并通过调节吞噬作用和凋亡来增强其免疫力和疾病抵抗力。这些发现表明EGCG作为减少氟苯尼考诱导的免疫毒性的治疗剂具有潜力。

引言

Procambarus clarkii（俗称小龙虾）是全球分布最广的小龙虾物种（Chu等，2019年）。1929年，红沼泽小龙虾P. clarkii被引入中国江苏省南京市，此后在多个地区广泛养殖（Li等，2023年）。与脊椎动物不同，虾和蟹等甲壳类动物在面对病原体威胁时仅依赖先天免疫。大量抗生素被用来增强甲壳类动物的免疫力。目前，抗生素耐药性是全球最大的公共卫生挑战之一（Chen等，2020年）。此外，还需要认识到抗生素对水生环境的潜在负面影响。它们会诱导抗生素耐药基因的产生，增加健康和环境风险。

在甲壳类动物中，核因子-κB（NF-κB）、STAT和IMD作为信号通路来调节身体的免疫反应。NF-κB信号通路与白斑综合征病毒（WSSV）感染有关，WSSV基因可能受NF-κB调控（Wang等，2013年）。在果蝇中，IMD信号通路是识别入侵细菌或真菌表面病原体相关分子模式的最佳表征的模式识别受体通路（Ferrandon等，2007年；Lemaitre和Hoffmann，2007年）。IMD信号通路可被病毒激活，并有助于限制病毒复制（Deniz Ertürk-Hasdemir等，2009年）。STAT蛋白进入细胞核，在抗病毒蛋白的表达中起调节作用，从而抑制病毒复制（Si等，2024年）。Crustin是一类抗菌肽，是抑制病原体感染最重要的体液因子之一（Jiang等，2022年）。抗生素耐药性是一个严重问题。抗脂多糖因子（ALFs）可以自然降低细菌耐药性，对多种耐药细菌有效（Kamsaeng等，2017年）。Crustacyanin-A1亚单位（CTN-A1）类似物可以结合色素，也是一种参与类胡萝卜素运输和沉积的主要蛋白质。类胡萝卜素是天然色素，在水生动物的生长、发育、免疫和体色中起重要作用（Naomi等，2003年）。caspases是程序性细胞死亡（凋亡）的关键调节因子，其中caspase-3是一种经常被激活的死亡蛋白酶，能催化许多关键细胞蛋白的特异性切割（Alan，1999年）。溶菌酶（LZM）可以破坏细菌细胞壁的键并分解多糖，导致细胞壁破裂和细菌溶解。它还可以与病毒蛋白相互作用以使病毒失活（Ekblom等，2024年）。Rab5属于RabGTPases蛋白家族，对调节运输细胞器尤其是吞噬体形成至关重要。细菌和病毒感染参与小龙虾的免疫反应（Zhu等，2022年）。Rab7参与内体分选、溶酶体生物发生和吞噬作用的调节机制（Wang等，2019年）。70-kDa热休克蛋白（Hsp70s）是分子伴侣和折叠催化剂的细胞网络的核心组成部分，有助于多种折叠过程（Mayer和Bukau，2005年）。铁蛋白是一种主要的铁储存蛋白，在铁稳态中起重要作用（Zhang等，2015年）。它不仅可以作为细胞铁的生理来源（Durand等，2004年），还具有解毒功能（Zhang等，2006年）。肌浆钙结合蛋白（SCP）参与肌肉收缩（Gao等，2006年）。Troponin C（TNNC）促进钙离子结合（Smietana等，2025年）。

氟苯尼考是一种专门用于兽医领域的氨基酚类（Aps）化合物，其分子式为C₁₂H₁₄C₁₂FNO₄S。自20世纪90年代初上市以来，由于其高效性、广泛应用、安全性和动物适用性，氟苯尼考在水产养殖领域得到了广泛使用。氟苯尼考对多种细菌菌株（包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌）表现出强大的杀菌效果。它还对革兰氏阳性厌氧菌、螺旋体、阿米巴和立克次体具有很强的活性。研究表明，氟苯尼考对多种水生动物具有积极的抗菌效果。在水产养殖中，氟苯尼考最初被用于治疗黄尾鱼的链球菌病和假核牛杆菌病，以及大西洋鲑鱼的天然疖病爆发（Chen等，2020年）。该物质已被证明对由弧菌和Aeromonas hydrophila引起的感染具有积极的治疗效果，这两种病原体对甲壳类动物敏感（Chen等，2020年；Song等，2017年）。与其他常见抗菌药物相比，它显示出更有效的治疗效果。然而，长期在水产养殖中使用氟苯尼考导致常见病原菌逐渐产生耐药性。抗生素耐药性是目前全球最大的公共卫生挑战之一，到2050年可能导致全球约1000万人死亡（Bengtsson-Palme和Larsson，2016年）。此外，还需要认识到抗生素对水生环境的潜在负面影响。它们会诱导抗生素耐药基因的产生，增加健康和环境风险。然而，根据最近的研究，即使在最大残留限（MRL）水平下，饮食中接触抗生素残留物也可能有利于肠道微生物群中潜在耐药细菌的生长（Subirats等，2019年）。抗生素耐药性是目前全球最大的公共卫生挑战之一，到2050年可能导致全球约1000万人死亡（Zhou等，2020年）。然而，根据最近的研究，即使在最大残留限水平下，饮食中接触抗生素残留物也可能导致肠道微生物群中潜在耐药细菌的生长。

表没食子儿茶素没食子酸酯是一种属于儿茶素家族的多酚。EGCG的化学式为C₂₂H₁₈O₁₁，其系统名称为(2R,3R)-5,7-二羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-3,4-二氢-2H-chromene-3-yl 3,4,5-三羟基苯甲酸酯。包括EGCG在内的这些化合物以其强大的抗氧化特性而闻名，这些特性可以保护细胞免受自由基的损伤（Coyle和Philips，2008年；Chen等，2009年）。研究表明，EGCG可以通过多种机制减少砷引起的的心脏毒性。这些机制包括减少ROS的产生、维持钙稳态和降低caspase-3的活性（Sun等，2016年）。此外，EGCG还被证明可以防止H₂O₂引起的氧化应激、损伤和膀胱细胞死亡（Coyle和Philips，2008年）。其机制可能与其强大的抗氧化能力有关。有假设认为EGCG可以保护细胞免受自由基的损伤，并减少磺胺甲噁唑的免疫毒性（Zhang等，2024年）。EGCG已被证明可以通过抑制凋亡过程和由强效物质ACR诱导的中枢神经系统星形胶质细胞的增殖来保护大鼠的大脑皮层免受损伤，并通过减少氧化应激（He等，2017年）。此外，EGCG还被证明可以减少炎症并预防心脏病、糖尿病等慢性疾病。研究表明，EGCG可以在体外降低胰岛素活性（Wu等，2004年）。在体内，该物质显示出减少氧化应激和蛋白酶膜转运的潜力。此外，它还被证明可以激活蛋白激酶（AMPK）信号通路，改善胰岛素信号通路，并增强游离脂肪酸（FFA）引起的胰岛抵抗（Li等，2011年）。多项研究表明，EGCG在增强细胞代谢和解毒过程中起关键作用，从而减少有害外部物质造成的损伤（Chen等，2009年）。在大鼠中，用抗肿瘤药物DOX处理会导致核因子-κB（NF-κB）的激活和炎症反应，而EGCG可以通过抑制因子激动作用来减轻炎症反应（Saeed等，2015年）。研究表明，EGCG可以调节免疫反应，增强免疫细胞的活性并减少SMZ诱导的免疫细胞凋亡（Zhang等，2024年）。体内研究表明，EGCG可以通过诱导prophenoloxidase和JAK-STAT通路来抑制WSSV的复制并提高存活率（Wang等，2017年）。本研究证明EGCG在Hepa1-6、L6和3T3-L1细胞以及小鼠肝组织中激活了AMPK（Hwang等，2005年）。EGCG是绿茶中公认的成分，具有强大的抗氧化特性。这些特性已被证明可以保护细胞免受自由基的损伤（Coyle和Philips，2008年）。关于EGCG的研究主要限于哺乳动物和模式动物。最初，EGCG被鉴定为早茶中的天然诱变剂（Kada等，1985年）。随后，发现EGCG对小鼠具有放射保护作用（Uchida等，1992年）。研究表明，EGCG可以减少磺胺甲噁唑残留物对水生生物的免疫毒性（Zhang等，2024年）。本研究更详细地探讨了EGCG在甲壳类动物中的作用。然而，目前尚无确凿证据支持其对氟苯尼考的直接影响。需要进一步全面的研究来探讨EGCG作为免疫增强剂的潜力。

本研究探讨了EGCG对氟苯尼考诱导的免疫毒性的影响，旨在为探索EGCG在小龙虾先天免疫功能和血细胞增殖中的作用提供实验证据。此外，该研究还试图确定如何减少抗生素对经济水生动物的影响。

部分摘录

动物和病原体

小龙虾（23 ± 3克）来自中国广东省湛江市的一个水产养殖场。在实验开始前，将每组12只实验动物放入清水中观察两天，以减少实验动物压力造成的过度实验误差。水温保持在23-25°C范围内，动物在新鲜水箱中饲养

血细胞凋亡

最初，使用流式细胞术分析了实验组。结果散点图和条形图（图1）显示，氟苯尼考（FF）组的凋亡率低于磷酸盐缓冲盐水（PBS）组。研究表明，与FF组相比，EGCG注射显著增加了凋亡率。此外，还测量了总血细胞计数（THC），相应的条形图显示

讨论

近年来，由药物残留物引起的环境和食物污染问题引起了全球的广泛关注。畜牧业和水产养殖的集约化导致兽医药品的广泛使用。据估计，80%的食用动物在其一生中至少接受过一次药物治疗（Andersson和Hughes，2012年）。然而，抗生素或化学物质的使用通常只针对某一类病原体

作者声明

我们在工作的构思或设计、数据获取、分析或解释方面做出了实质性贡献。FZ负责构思和设计研究。YZ和YL进行了实验。YZ和YL分析了数据。YZ撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了手稿。通讯作者负责确保描述准确并得到所有作者的同意。我们起草了工作或对其进行了重要修订

作者贡献声明

赵玉杰：撰写——原始草稿，软件操作，调查，数据管理。李一琳：调查。朱飞：撰写——审稿与编辑，项目管理。