Leiomodin-2 C端结合位点的定位及功能研究

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》：Localization and functional exploration of leiomodin-2's C-terminal binding sites

Lmod2的C末端延伸通过三个独立侧结合区域调控肌动蛋白薄丝长度，其中聚脯氨酸区作为连接器维持结合距离，并可能与prolinin协同促进薄丝末端的肌动蛋白聚合。

　　

Mason D. Summers | Madison Little | Robert P. Young | Brayan Osegueda | Alan Palma Guillen | Garry E. Smith | John R. Cort | Vitold E. Galkin | Alla S. Kostyukova

美国华盛顿州立大学沃兰德化学工程与生物工程学院，普尔曼，华盛顿州

摘要

横纹肌的收缩是通过肌节内相互重叠的肌球蛋白基粗丝和肌动蛋白基细丝之间的相互作用实现的。为了有效收缩，必须保持细丝的长度，以确保其与粗丝有足够的重叠。Leiomodin和Tropomodulin这两种蛋白质竞争结合到细丝的末端，利用它们同源的N端肌动蛋白和原肌球蛋白结合位点来调节细丝的长度。Leiomodin还包含一个称为C端延伸区的结构，而Tropomodulin则没有这一结构。在该区域中，心脏特异性isoform（leiomodin-2）具有额外的肌动蛋白结合位点，使其能够以Ca²⁺依赖的方式结合到细丝的侧面。本文利用核磁共振光谱技术确定了C端延伸区中参与细丝侧面结合的残基位置。通过共沉淀实验发现，这些区域可以独立地与细丝结合，并且发现多脯氨酸区（poly-proline region）起到连接作用，维持了两个结合位点之间所需的适当距离，从而实现有效相互作用。

引言

横纹肌的正常收缩对于维持生命所需的许多关键过程至关重要。横纹肌收缩是由称为肌节的重复单元完成的，肌节内含有肌球蛋白基的粗丝，这些粗丝通过消耗能量沿肌动蛋白基的细丝（TFs）移动，从而在Ca²⁺释放时缩短肌肉长度并产生收缩力[1]、[2]。细丝中还含有原肌球蛋白（Tm）和肌钙蛋白（Tn），这两种蛋白质能够结合并稳定肌动蛋白丝（F-actin），并调节细丝与粗丝之间的Ca²⁺驱动的相互作用。不同类型和物种的肌肉中粗丝长度相对恒定[3]、[4]；然而，细丝的长度会因不同物种所需产生的收缩力而有所不同[4]、[5]，长度异常可能导致疾病。

Leiomodin（Lmod）和Tropomodulin（Tmod）是主要的肌动蛋白结合蛋白，负责细丝末端的形成和长度调节。已知的三种Lmod isoform中，有两种（Lmod2和Lmod3）存在于横纹肌中，其中Lmod2在心肌中占主导地位[6]、[7]。与Tmod的结构类似，Lmod2的N端部分包含两个肌动蛋白结合位点（ABSs）和一个原肌球蛋白结合位点（TmBS），使其能够结合到细丝末端并与心脏特异性isoform Tmod1竞争，根据需要促进细丝的延长[8]、[9]、[10]。Lmod2还具有一个约20 kDa的C端延伸区（C-terminal extension），该区域包含多脯氨酸区（polyP）和Wiskott-Aldrich同源结构2（WH2）结构域。WH2结构域已知能够结合肌动蛋白单体（G-actin）的1和3亚域以及F-actin的带刺末端[11]。在所有Lmod中，WH2结构域在肌动蛋白成核过程中起关键作用[12]、[13]。多脯氨酸区常见于像VASP这样的肌动蛋白结合蛋白中，这些蛋白能够结合profilin-actin复合物并促进G-actin的聚合[14]、[15]；然而，目前尚无证据表明任何Lmod isoform（包括Lmod2）能够结合profilin。

在心肌细胞中，Tmod1主要结合在细丝的末端[16]、[17]，而Lmod2则更广泛地分布在细丝末端周围[8]、[18]、[19]。此外，Lmod2还能结合到F-actin的侧面[18]、[20]、[21]，这表明Lmod2在心肌细胞细丝末端的广泛分布可能是由于它不仅结合在末端，还结合在细丝侧面。最近的研究表明，Lmod2通过C端延伸区的三个ABSs与细丝侧面结合[22]。无论Ca²⁺水平如何，这些位点都能与F-actin骨架上的连续三个肌动蛋白亚单体结合。我们提出，这些位点对应于C端延伸区中的三个区域：残基387–426、451–492以及WH2结构域[22]。Lmod2的C端ABSs的侧面结合能力可能对细丝的调节起着重要作用，因为该区域的突变会导致收缩功能障碍。例如，人类LMOD2的W398*突变（在小鼠心肌细胞中用同源突变W405*模拟）会导致致命的心肌病[23]，这进一步强调了探索这一机制的重要性。

本文通过研究Lmod2片段与F-actin的结合能力，确定了参与细丝侧面结合的三个C端区域的位置（即L-ABRs）。我们证明了这些区域可以独立地与细丝结合，并且多脯氨酸区（polyP region）在L-ABR1和L-ABR2之间起到连接作用，维持了它们之间有效的相互作用所需的距离。除了其在细丝侧面结合中的作用外，我们还发现多脯氨酸区（polyP region）能与profilin相互作用，并提出Lmod2可能通过促进profilin结合的肌动蛋白在细丝末端的聚合来发挥新的功能。

C端Lmod2片段的设计

为了更精确地定位Lmod2 C端延伸区的结合位点，我们使用了核磁共振（NMR）光谱技术。当多肽与结合伴侣相互作用时，其NMR谱会发生变化，这些变化可用于绘制结合界面[24]、[25]。该方法依赖于NMR在特定动力学范围内检测相互作用的能力[26]。弱相互作用（解离常数在微摩尔到毫摩尔范围内）通常会产生明显的谱线变化。

结论

目前对Lmod2在肌节中功能的认识未能准确反映C端延伸区对肌节调节的贡献。本文首次全面描述了C端延伸区的结构及其潜在功能，包括多脯氨酸区（polyP region）与profilin之间相互作用的证据，这可能对Lmod2在肌节中的长度调节至关重要。

我们之前的研究发现了两个新的……（此处原文内容不完整）

重组Lmod2 C端片段的克隆

小鼠Lmod2（NP_444328.1）的氨基酸序列经过优化，使其能够在不含EcoRI、XhoI和NdeI限制酶的大肠杆菌（菌株K12）中表达，优化工作由NovoPro Bioscience Inc.的ExpOptimizer工具完成（https://www.novoprolabs.com/tools/codon-optimization）。该DNA序列被克隆到了GenScript（美国新泽西州皮斯卡特韦）公司的pUC57质粒中。用于克隆Lmod2残基454–521和374–550的引物分别针对pET21b(+)载体上的EcoRI和XhoI限制位点进行设计。

CRediT作者贡献声明

Mason D. Summers：撰写 – 审稿与编辑，撰写初稿，数据可视化，结果验证，资源准备，方法设计，实验设计，数据分析。 Madison Little：撰写 – 审稿与编辑，撰写初稿，数据可视化，结果验证，资源准备，方法设计，实验设计，数据分析。 Robert P. Young：撰写 – 审稿与编辑，方法设计，实验设计。 Brayan Osegueda：撰写 – 审稿与编辑，资源准备，实验设计。 Alan Palma Guillen：撰写 – 审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助（项目编号R01 GM120137，资助对象ASK和VEG）。BO得到了NIH的T34 GM141971培训项目的支持，资助对象为华盛顿州立大学（WSU）。APG得到了NIH的T25 EB027606培训项目的支持，资助对象同样为WSU。MDS和ML得到了蛋白质生物技术培训计划（Protein Biotechnology Training Program）的资助（项目编号T32 GM152310，资助对象为WSU）。

作者感谢Carol C. Gregorio博士和Tania M. Larrinaga提供了全长Lmod2、Lmod2[1-524]、Lmod2Δ17等蛋白。