组氨酸的行为对Tau R3片段中富含β-折叠的结构二聚体形成的影响：关于初级成核过程的新见解

《Biophysical Chemistry》：Histidine behaviors effect on β-sheet-rich dimer formation of Tau R3 fragment: New insights on primary nucleation processes

Tau蛋白R3重复片段在不同His残基异构体下的二聚体形成机制研究。通过九次独立全息交换分子动力学模拟，发现R3(εδ)-R3(εδ)系统β-折叠含量最高，且His25、26的ε/δ异构体通过氢键网络促进R3重排。高β-折叠系统呈现保守的三/四β-折叠结构，其中一条链的强内链氢键与另一链的跨链氢键协同稳定二聚体。揭示了His残基在维持主链及侧链氢键中的关键作用，为Tau蛋白聚集的初始阶段机制及基于片段的模型构建提供新视角。

　　

胡适|李静|孙月|王丽莎|闫莉|蒲鑫

山西大学分子科学研究所化学与化学工程学院，太原030006，中国

摘要

pH值的微小变化会显著影响Tau蛋白的初级成核过程。组氨酸由于其在调节氢键网络和静电相互作用中的关键作用而受到了广泛关注。然而，其确切的成核机制及涉及的中间体仍不清楚。在本研究中，我们进行了九次独立的复制交换分子动力学模拟，以研究由R3(εδ)二聚体与不同R3单体结合形成的过程。我们的研究结果表明，R3(εε)-R3(εδ)系统始终表现出最高的平均β-折叠片含量，这表明R3(εδ)促进了R3的重新排列。我们的综合分析揭示，高β-折叠片含量的系统具有保守的三/四β-链结构。在这些富含β-链的系统中，一条链（R3或R3(εδ)）通过链内氢键相互作用与另一条链协同工作，从而提高了整体稳定性。此外，我们还探讨了组氨酸的独特行为，包括其在主链和侧链内的相互作用，以及它作为供体和受体的角色。本研究为可溶性Tau寡聚体的R3介导的聚集倾向提供了见解，并提出了一个基于片段的模型来阐明初级成核机制。它为蛋白质折叠和错误折叠提供了新的视角。

引言

蛋白质的构象最初是一个未折叠的肽链，没有稳定的三级结构。然而，通过氨基酸残基之间的复杂相互作用，它经历了一个称为蛋白质折叠的过程[1]，[2]。这一过程逐渐导致获得具有明确三维结构和精确功能特性的构象。蛋白质折叠是一个复杂且动态的现象，受到多种因素的精细调控[3]。外部因素，包括氨基酸序列的变化、聚集体的积累以及环境参数（如温度、pH值、氧化还原条件和离子浓度）的改变，都会对折叠过程产生显著影响，可能导致蛋白质错误折叠[4]，[5]。这种错误折叠事件包括一系列病理现象，会干扰细胞和生物体的功能[6]。它已被证实与多种疾病的发病机制有关[7]，特别是神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病、亨廷顿病，以及包括肾淀粉样变性和系统性淀粉样变性在内的退行性疾病。这些疾病的特点是错误折叠蛋白质的积累，导致不溶性聚集体的形成或淀粉样纤维的形成，从而损害细胞过程并导致组织损伤和功能障碍[8]，[9]。

神经退行性疾病是一组异质性疾病，其特征是神经系统内神经元的逐渐退化和随后的丧失[10]。在这些疾病中，AD是最常见的老年痴呆症原因[11]。它有两个显著的病理学特征：由β-淀粉样（Aβ）肽的细胞外和细胞内沉积形成的老年斑（SP），以及由神经元内Tau蛋白异常磷酸化引起的神经纤维缠结（NFT）[12]，[13]，[14]。老年斑的存在会破坏神经元间的信号传递，导致部分神经元功能障碍，并引发免疫反应，从而促进慢性炎症状态[15]，[16]。相反，NFT的发展会干扰神经元内的正常运输和通信过程，最终导致神经元功能受损和随后的退化[17]。

与具有稳定折叠的球状蛋白不同，Tau是一种高度动态的、本质上无序的蛋白质（IDP），其天然状态缺乏明确的三级结构[18]，[19]，主要处于未折叠状态，采用α-螺旋和β-折叠片二级结构的比例不到10%[20]，[21]，[22]。它是微管相关蛋白家族的成员，主要在神经元细胞中表达，在神经元生长和功能中起关键作用[23]，[24]。具体来说，Tau蛋白定位于微管表面，在那里它结合并维持细胞骨架结构，促进神经元内的正常运输[25]。Tau蛋白的生物合成需要翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化、糖基化和泛素化以及氧化，以实现其全部功能[20]，[26]。这些修饰产生了多种Tau异构体，导致二级结构的变化，包括α-螺旋和β-折叠片含量的变化[27]，[28]。其中，磷酸化具有特别重要的意义。Tau的磷酸化水平由特定酶调节，如果激酶活性增强而磷酸酶活性降低，则会破坏平衡，导致Tau蛋白过度磷酸化[27]，[29]。这种过度磷酸化会降低Tau对微管的亲和力，导致细胞骨架不稳定、轴突运输受损以及蛋白质的构象错误折叠[26]。在中枢神经系统中，Tau异构体是通过外显子2、3和10的选择性剪接产生的，3R和4R异构体的比例大致相等（50%:50%）[30]。这些异构体之间的平衡对Tau蛋白的功能至关重要，因为即使是微小的偏差也会影响其生物活性。值得注意的是，4R异构体对微管的亲和力更高，从而促进微管的稳定[27]，[31]。Tau蛋白的结构由不同的结构域组成，包括N端区域、富含脯氨酸的区域（PRD）、微管结合域（MBD）和C端区域[32]，[33]。导致神经纤维缠结形成的复杂聚集过程包括一系列复杂的步骤，包括初级成核、次级成核以及纤维的延伸和延长[34]，[35]，[36]。在初级成核阶段，错误折叠的Tau单体发生寡聚化，形成可溶性的寡聚体，如二聚体和三聚体[22]。这些可溶性寡聚体随后参与次级成核，形成原纤维，进一步延长并形成成熟的纤维缠结[22]。初级成核通常会产生寡聚体中间体，在AD的病理背景下观察到的可溶性寡聚体被认为是最具危害性的Tau蛋白形式，具有神经毒性[37]。初级成核的聚集可以受到许多因素的影响，包括金属（取决于锌的配位环境和肽与锌的化学计量比[38]）、特定的氨基酸残基（如组氨酸和酪氨酸残基[39]）以及pH值[40]（pH值对初级成核有很强的依赖性）。因此，全面研究这些寡聚体的结构和聚集特性对于揭示AD病理的潜在机制至关重要。

组氨酸的咪唑侧链独特地采用三种依赖质子化的状态，包括ε-互变异构体（HIE, ε）、δ-互变异构体（HID, δ）或完全质子化的（HIP, 简化为(p)状态），每种状态都赋予不同的氢键特征[41]，[42]。在气相中，ε:δ的比率理论上是1:0.16[43]。然而，这两种互变异构状态处于动态平衡中。一旦外部环境发生变化（pH值、离子浓度和咪唑环的N原子取向），互变异构状态的比例就会受到影响[44]，[45]。微小的pH值变化会显著影响Tau蛋白的初级成核过程。由于组氨酸残基是唯一一个在接近中性生理环境中pKa值为6.5的残基，因此组氨酸的行为应与AD的发病机制和病理过程密切相关[46]，[47]。具体来说，它可以被视为影响蛋白质空间结构和聚集特性的潜在竞争性候选因素，直接或间接影响肽链氢键相互作用网络的形成，以及净电荷分布的性质，进而影响肽链的结构特征和聚集特性[48]，这一点已在蛋白质的计算模拟中得到证实和应用[49]，[50]。

在我们之前的研究中，我们专注于阐明组氨酸行为对Tau蛋白中微管结合域（MBD）的结构属性和聚集倾向的影响[51]。具体来说，我们的研究检查了包含R1、R2、R3和R4的四个重复片段，发现R3(εδ)表现出以稳定β-折叠片结构为特征的构象。特别值得注意的是组氨酸H25和H26之间的协同相互作用，这对形成重要的氢键网络起到了重要作用。此外，我们还研究了由R1、R2和R4的不同单体与R3(εδ)形成的二聚体的初始成核过程，以探讨组氨酸行为对结构和聚集特性的影响[52]。R3(εδ)的三β-折叠片构象来源于我们之前的REMD模拟[52]，选择这个片段是因为R3形成稳定β-折叠片的倾向（>80%的持久性），我们认为这个片段在后续聚集中可能起关键作用。然而，在组氨酸行为的背景下，控制Tau蛋白初级成核过程的全面机制仍不清楚。为了填补这一知识空白，我们选择R3(εδ)作为“种子”链，研究与不同的R3单体结合形成二聚体。具体的R3片段序列如图1a所示。考虑到图1a中R3单体中位置25和26的组氨酸处于三种状态（ε、δ和p），我们将二聚体系统定义为R3(εε)-R3(εδ)、R3(εδ)-R3(εδ)、R3(δδ)-R3(εδ)、R3(δε)-R3(εδ)、R3(pp)-R3(εδ)、R3(pδ)-R3(εδ)、R3(pε)-R3(εδ)、R3(δp)-R3(εδ)和R3(εp)-R3(εδ)。因此，我们进行了九次独立的复制交换分子动力学（REMD）模拟，以研究这些二聚体的结构特征，并探讨它们在涉及R3重复片段的初级成核过程中的聚集特性。这项全面的研究旨在提供关于R3介导的聚集倾向的驱动因素的见解，阐明初级成核机制，并进一步丰富我们对组氨酸行为的理解。此外，我们的研究为蛋白质折叠和错误折叠过程的聚集机制提供了新的视角。

材料与方法

用于REMD模拟的R3和R3(εδ)片段的初始结构是使用Amber 18软件包中的tleap模块生成的[53]。为了构建这些系统，将R3片段氨基酸序列中位置25和26的组氨酸残基替换为δ、ε或p状态。REMD模拟使用ff14SBonlysc力场[54]和隐式水模型（igb = 8）进行。

结果与讨论

基于我们之前的限制策略经验[62]，我们在单体之间实施了50 ?的距离约束。这一刻意的选择旨在促进广泛的构象采样，同时尽量减少初始构象对后续结果的影响。有关此设置的详细信息可以在图S2中找到。为了评估我们独立REMD模拟的收敛性，我们使用了聚类分布特征分析。

结论

本研究利用九次REMD模拟来探索R3介导的初级成核事件，作为tau聚集的模型系统，特别关注组氨酸行为的影响。结合自由能分析显示，所有二聚体配置的值都是负的，表明有聚集倾向和二聚体稳定性增加。特别是，R3(εε)-R3(εδ)、R3(δε)-R3(εδ)和R3(pε)-R3(εδ)系统的结合自由能显著较低，表明

作者贡献

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CRediT作者贡献声明

胡适：写作 – 审稿与编辑、监督、资源提供、概念化。李静：写作 – 原稿撰写、研究、数据管理。孙月：研究、数据管理。王丽莎：研究、数据管理。闫莉：数据管理。蒲鑫：写作 – 原稿撰写、资源提供。

资助

本研究得到了山西省科学技术（编号：20210302124490）和山西省引进海外专业人员的科学研究活动（编号：20220053）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。