半理性设计嗜冷纤维二糖2-差向异构酶以提高底物亲和力和增强低温下的差向异构化活性

《Bioresource Technology》：Semi-rational design of psychrophilic cellobiose 2-epimerase for improved substrate affinity and enhanced low-temperature epimerization activity

细胞壁分解酶低温催化活性优化及机制研究。采用荧光筛选和饱和突变体库构建策略，通过GFP融合表达系统精确鉴定突变体，成功获得双突变体FR。该突变体在8℃下乳糖转差向糖效率提升40%，催化周转率达245.7 s?1，结合动力学模拟和结构分析，揭示其扩大的结合口袋和增强的氢键网络机制。该研究建立了低温酶定向进化平台，为乳制品低温加工提供高效生物催化剂。

　　

胡旭|吕年楠|刘永琴

兰州大学生态学院，中国兰州730000

摘要

嗜冷型纤维二糖2-差向异构酶（CE）是一种有前景的生物催化剂，适用于低温乳制品制造过程，但其工业应用受到低温活性与底物亲和力之间固有矛盾的制约。为克服这一限制，我们对嗜冷型CE（psyCE）采用了半理性设计策略。我们开发了一种基于GFP的荧光测定方法来标准化突变体表达，从而能够精确识别活性提升的情况。结构分析确定了六个关键残基进行靶向突变，并据此构建了一个饱和突变体文库。文库筛选出了一种具有优异动力学特性的双突变体（FR）。FR变体表现出创纪录的催化转化率（245.7?s^?1 vs. 219.9?s^?1）和更高的底物亲和力（208.9?mM vs. 261.9?mM），使得整体催化效率提高了40%。在实际的8?°C生物催化实验中，FR在3?小时内产出了21%的乳糖异构体，优于野生型（4?小时内仅产出了20%）。分子动力学模拟揭示了这种提升的结构基础：FR突变体形成了更大的结合口袋，并同时增强了氢键网络。本研究不仅提供了一种高效的低温活性生物催化剂，还为嗜冷酶的工程改造建立了一个筛选平台。

引言

在乳制品行业中，低温下的酶促加工更受青睐，因为这样可以保持对热敏感成分的营养价值和感官特性（Adapa等，2014；Liang等，2023；Wang等，2023）。纤维二糖2-差向异构酶（CE，EC 5.1.3.11）能将乳制品中的大量副产物乳糖转化为高价值的乳糖异构体，具有广泛的应用前景（Chen等，2018）。乳糖异构体具有多种益生元功效，如促进有益肠道菌群（如双歧杆菌和乳酸菌）的生长、增强钙吸收以及调节脂质代谢，使其成为食品和营养保健品行业中传统功能性糖类的有吸引力的替代品（Cardoso等，2024；Mu等，2013；Murakami等，2015；Nishimukai等，2008；Watanabe等，2008；Xiong等，2024）。然而，大多数已研究的CE来自中温或耐热微生物，在低温条件下表现不佳，限制了其在冷链加工中的应用（Chen等，2020；Pang等，2025）。最近发现的嗜冷型CE（如Roin-CE和Trbr-CE）在低温下仍能保持高催化活性，为乳糖异构体的低温生产带来了希望（Chen等，2021；Chen等，2020）。不过，它们相对较低的催化转化率（k_cat）仍然限制了其更广泛的工业应用。

最近，通过分子动力学（MD）模拟辅助筛选，从青藏高原冰川宏基因组中分离出一种新型纤维二糖2-差向异构酶（psyCE）。psyCE具有内在的结构不稳定性、在中等温度下的显著热不稳定性和在低温下的高催化活性，是已知的首种能够高效催化乳糖差向异构化的嗜冷型CE（Xu等，2024a）。尽管psyCE在所有嗜冷型CE中具有最高的k_cat值，但它仍存在典型的嗜冷型酶的矛盾：为了适应低温，其灵活且松散的结构导致底物亲和力降低（米氏常数K_m较高），从而使得整体催化效率较低（k_cat/K_m较低）（Collins和Feller，2023；Feller和Gerday，2003）。这些限制凸显了需要进行半理性工程改造，以在不牺牲其低温适应特性的前提下提高底物亲和力。

在这项研究中，我们结合结构导向的突变技术和荧光辅助筛选系统来提升psyCE的催化效率。我们构建了GFP-psyCE融合蛋白，将荧光强度与可溶性表达相关联，从而能够半定量地排除假阳性结果。基于“靶向催化色氨酸和底物结合口袋附近的残基会重新配置局部相互作用网络”的假设，我们生成并筛选了一个饱和突变体文库。最终获得的双突变体（FR）表现出显著提升的活性和底物亲和力，其催化转化率达到了已知嗜冷型CE中的最高水平。通过结构分析和分子动力学模拟，我们探讨了这种提升的分子机制，揭示了结合口袋的扩大以及氢键网络的增强。这些发现为快速优化适用于乳制品生产的嗜冷型生物催化剂提供了一个可靠的平台。

章节片段

化学试剂和菌株

异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖（IPTG）和氨苄西林钠盐购自Ambeed（美国）。乳糖异构体和乳糖由Aladdin（上海，中国）提供。氰硼氢化钠、四丁基硫酸铵和对氨基苯甲酸由Meryer（上海，中国）提供。E. coli BL21（DE3）和DH5α感受态细胞来自TransGen Biotech（北京，中国）。引物由RuiBiotech（北京，中国）合成。PrimeSTAR Max DNA聚合酶和DpnI

关键氨基酸残基的鉴定

修改靠近底物的残基是提高酶活性和底物亲和力的有效策略（Packer & Liu，2015）。先前的研究表明，重新设计底物结合口袋可以增加异构化活性（Wu等，2025）；同时靶向底物附近的残基以及两个关键色氨酸残基可以提升亲和力和活性（Wang等，2022a）。在Casa-CE中，W308和W372对催化过程至关重要

结论

总之，我们开发了一种基于GFP的荧光辅助筛选系统，用于半定量鉴定嗜冷型酶突变体。通过饱和突变后进行荧光辅助筛选，得到了双突变体psyCE-N309F/K189R（FR），其异构化活性比野生型高约1.25倍。在8?°C条件下转化乳糖时，FR突变体在4?小时内产生的乳糖异构体产量比野生型高出15–20%。

未引用的参考文献

Wang等，2022；Wang等，2022；Xu等，2024；Xu等，2024。

CRediT作者贡献声明

胡旭：撰写原始草稿、验证、软件开发、方法设计、实验研究、数据分析、概念构思。吕年楠：撰写原始草稿、软件开发、数据分析。刘永琴：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：42330410和42421001）的支持。