揭示球形小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的差异性耐盐机制：酸性、中性和碱性盐度胁迫的系统性比较

《Bioresource Technology》：Unraveling differential salt tolerance mechanisms in Chlorella pyrenoidosa: systemic comparison of acidic, neutral, and alkaline salinity stresses

盐胁迫（中性、酸性、碱性）显著抑制微藻生长，酸性盐（如NaHSO?）毒性最强，导致66%生物质损失及脯氨酸24倍积累。生理响应以抗氧化酶激活为主，转录组分析显示胁迫下生长相关基因（光合作用、DNA修复）下调，生存相关基因（三羧酸循环、膜运输）上调。研究为微藻盐胁迫适应机制及SDGs应用提供依据。

　　

Xu Li|Xiang Liu|Honggu Ji|Zengzhen Du|Lei Zhang

重庆理工大学化学与化学工程学院，中国重庆 400054

摘要

来自不同来源的盐胁迫（包括中性盐、酸性盐和碱性盐）通过导致严重的生物量损失和生理功能障碍，极大地限制了微藻的应用。为了研究模式藻类Chlorella pyrenoidosa对这些胁迫的响应机制，我们在六种代表性的盐处理条件下进行了生理学和转录组分析：中性盐（NaCl, Na₂SO₄）、碱性盐（Na₂CO₃, NaHCO₃）和酸性盐（NaHSO₄, NaH₂PO₄）。尽管NaHSO₄的浓度仅为0.004 M，但它导致的生物量减少最为显著（66.0%）。生理学分析显示，中性盐和碱性盐主要激活了超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等酶类抗氧化剂，而酸性盐则主要通过脯氨酸的积累来缓解胁迫，在0.004 M NaHSO₄和0.4 M NaH₂PO₄处理下，脯氨酸的积累分别增加了19.7倍和24.1倍。转录组分析揭示了一种普遍存在的、保守的胁迫响应机制，其特征是生长所需的高能耗过程（如光合作用、DNA修复和蛋白质合成）下调，而与即时生存相关的途径（如蔗糖生物合成、三羧酸循环、膜转运和蛋白质周转）上调。根据联合国可持续发展目标（SDGs），盐胁迫对微藻在“提供负担得起和清洁的能源”（SDG 7，影响程度为53.0%）和“消除饥饿”（SDG 2，影响程度为20.3%）方面的贡献影响最大，这突显了缓解这些胁迫的经济重要性。这些发现加深了我们对微藻在生理和分子水平上如何适应盐胁迫的理解。

引言

土壤盐碱化通过引起渗透压和离子胁迫，破坏细胞稳态并抑制微藻生长（Pei和Yu，2023年；Sarsekeyeva等人，2024年），对微藻产生不利影响。全球大约10.7%的陆地面积已经盐碱化（FAO，2024年），严重限制了可用于微藻生物质生产的非耕地面积。此外，复杂的工业废水（如pH值为2–4、HSO₄^?浓度高的酸性矿井排水）加剧了盐胁迫（Johnson和Hallberg，2005年）。解决这些问题需要更深入地了解微藻对盐胁迫的生理和分子响应，这对于通过适应性进化或基因工程培育耐盐菌株至关重要。

微藻是高效的光合细胞工厂，具有显著的潜力，可以用于实现碳中和、生产生物燃料、高价值色素和多不饱和脂肪酸（Wu等人，2022年）。在实际应用中，微藻面临来自酸性盐（如NaHSO₄, NaH₂PO₄）、中性盐（如NaCl, Na₂SO₄）和碱性盐（如Na₂CO₃, NaHCO₃）的多种盐胁迫，这些胁迫限制了基于微藻的技术的规模化应用（Vo等人，2020年）。其中，NaCl是最被广泛研究的盐类：虽然NaCl会抑制生长，但它会诱导类胡萝卜素和脂质等代谢产物的积累（Farkas等人，2023年；Kou等人，2020年；Xue等人，2025年；Yang等人，2024年；You等人，2019年）。针对NaCl的适应机制包括渗透调节（Barera和Forlani，2023年；Singh等人，2018年；Tibesigwa等人，2025年）、抗氧化剂激活（Barera和Forlani，2023年；Singh等人，2018年；Sun等人，2018年）、离子稳态调节（Freyria等人，2024年；Pires等人，2013年；Wang等人，2020年）以及光合作用保护（Neelam和Subramanyam，2013年）。相比之下，对其他类型盐的研究仍然有限。硫酸盐（SO₄^2?）在废水和盐碱土中很常见（Galiana-Aleixandre等人，2005年），在低浓度下对微藻生长是必需的，但在高浓度（>3 mM）下由于渗透压和离子毒性而具有抑制作用（Mera等人，2016年；Zhang等人，2019b年）；在硫缺乏时，硫代谢基因会上调以维持稳态（Xu等人，2022年）。像亚硫酸氢盐（HSO₃^?）这样的酸性盐会严重抑制生长——3.375 mM的HSO₃^?可使叶绿素减少85%，并通过酸化作用和PSII损伤停止光合作用（Peng等人，2024年）。碱性盐不仅会引起渗透压和离子胁迫，还会导致高pH值相关的酶抑制、营养失衡和膜破坏（Zhu等人，2022年）。适量的HCO₃^?可以增加Chlorella的光合作用、生长和脂质积累（Lohman等人，2015年；Pedersen等人，2018年；Xia等人，2015年；Zhai等人，2020年），并调节多糖（Vergnes等人，2019年）、叶黄素（Sampathkumar和Gothandam，2019年）和β-胡萝卜素（Xi等人，2020年）的生成。然而，目前关于微藻中酸性和碱性盐的研究主要集中在生理学层面，其分子机制和比较适应策略仍不甚清楚。

工业废水通常含有多种盐的复杂混合物，包括酸性盐、碱性盐和中性盐。每种盐类型都会引发独特的离子效应，引起特定的pH值变化，并触发不同的细胞毒性机制。然而，相关文献零散，研究使用的盐类型和微藻种类也各不相同。这种异质性严重限制了结果的可比性，阻碍了对盐特异性效应的统一理解。

为了解决这一问题，本研究选择了Chlorella pyrenoidosa作为模式生物，因为它具有明确的盐敏感性、快速的生长速率和可用的基因组资源（Fan等人，2015年；Zhang等人，2019a年；Zhou等人，2024年）。我们系统地研究了C. pyrenoidosa对多种盐（包括中性盐NaCl、Na₂SO₄、碱性盐Na₂CO₃和酸性盐NaHSO₄, NaH₂PO₄）的生理和转录组响应。通过在单一物种框架内进行平行的生理学和转录组分析，这种方法能够直接比较不同盐的效果，从而克服了以往零散研究的局限性，超越了仅以NaCl为视角的局限性。

菌株和培养基

本研究中使用的微藻菌株是Chlorella pyrenoidosa FACHB-9。C. pyrenoidosa在BG-11培养基中培养，其成分详见补充材料。

实验设计

C. pyrenoidosa被接种到添加了各种盐的BG-11培养基中，初始生物量浓度为0.18 g/L。培养在带有光照的培养箱（型号ZGZ-450C，Binglin）中进行，控制条件为：温度25°C，光照强度60 μmol/(m²·s)，光照时间12小时/黑暗时间12小时

C. pyrenoidosa

对各种盐胁迫的生长响应

C. pyrenoidosa在六种盐胁迫条件下的培养过程和采样计划如图1a所示。在中性盐胁迫（NaCl和Na₂SO₄）下，随着盐浓度的增加，C. pyrenoidosa的生物量浓度逐渐下降（图1b）。在0.4 M NaCl和0.4 M Na₂SO₄处理下，生物量浓度分别下降了45.8%和52.5%，而细胞密度仅下降了24.5%和44.7%（图1c）。

不同盐类型下生长抑制和毒性的综合机制

我们的研究表明，C. pyrenoidosa的盐抑制作用不仅取决于离子强度，还受到阴离子化学性质和由此产生的pH值变化的深刻影响。NaHSO₄的极端毒性（表现为其低IC₅₀值）可以归因于离子胁迫和HSO₄^?水解产生的明显酸中毒的协同效应。这种双重影响可能同时破坏了膜电位和细胞内pH值的稳态，导致我们观察到的严重代谢失调。

结论

本研究通过揭示一种保守的胁迫响应机制（涉及与生长相关的过程转录下调以及生存相关途径的上调），并确定了特定盐类型的机制（尤其是酸性盐的严重毒性），显著推进了我们对微藻盐适应性的理解。这些发现为优化微藻在盐碱废水和盐碱土壤中的培养提供了重要的分子基础，并为相关应用提供了指导。

CRediT作者贡献声明

Xu Li：撰写——原始草稿、可视化、方法学、实验设计、数据整理。Xiang Liu：验证、方法学、数据整理。Honggu Ji：验证、方法学。Zengzhen Du：可视化。Lei Zhang：撰写——审稿与编辑、监督、软件使用、项目管理、资金筹集、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32202965）的支持。