《Methods and Protocols》：An MNase-ChIP-Seq Protocol to Profile Histone Modifications at a DNA Break in Yeast
Elena Di Nisio,
Chiara Frigerio,
Valerio Licursi,
Sara Castelli,
Benedetta Caraba,
Rodolfo Negri and
Michela Clerici
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本文推荐了一项在酿酒酵母中研究特定DNA双链断裂（DSB）位点组蛋白翻译后修饰（PTMs）的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）方案。该方案结合了微球菌核酸酶（MNase）消化，能够在高分辨率下全基因组范围内分析DNA损伤后动态的染色质修饰变化，为理解染色质动力学、DNA损伤响应与修复机制提供了重要的实验方法学支持。
1. 引言
DNA双链断裂（DSB）是细胞可能遭受的最危险的DNA损伤形式之一，可导致基因组不稳定。无论是酵母单倍体细胞还是修复通路缺陷的哺乳动物细胞，即使是单个未修复的DSB也常常具有高度细胞毒性，能够引发细胞周期停滞和死亡。为了应对这种高度有害的损伤，细胞启动了一个协调的响应过程，包括检测、信号传导和修复，以维持基因组的完整性。DSB主要有两种修复途径：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR），修复途径的选择取决于与断裂末端结合的蛋白质及其活性调控，其中DNA末端从5'到3'方向的核糖核酸水解对于产生促进同源搜索和重组的3'-末端单链DNA至关重要。
DNA DSB发生在染色质环境中，其响应受染色质修饰的调节。在核小体中，DNA缠绕在核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的八聚体上。从核小体伸出的组蛋白尾部会发生广泛的翻译后修饰（PTMs），包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化。这些修饰通过改变组蛋白-组蛋白或组蛋白-DNA的相互作用，或为其他染色质重塑因子提供结合位点，从而影响染色质结构。尽管多种组蛋白PTMs在促进不同修复通路中的作用已被阐明，但关于组蛋白PTM与DSB修复因子之间复杂相互作用的全面图景仍不清楚。
目前，染色质免疫沉淀（ChIP）和靶向切割与释放（CUT&RUN）是研究染色质结合蛋白和组蛋白PTMs全基因组分布最常用的方法。在ChIP中，细胞通常用甲醛处理以诱导蛋白质与DNA交联，随后通过超声或酶处理（如微球菌核酸酶，MNase）将染色质片段化。MNase优先消化核小体间的裸露DNA，从而释放受核小体保护的DNA片段，这对于研究组蛋白PTMs、产生高分辨率数据并消除由交联引起的信号假象特别有用。相比之下，CUT&RUN等新方法虽然所需起始细胞量少，但在研究酵母等材料丰富的细胞时，其优势并不明显。尤其对于存在细胞壁的酵母细胞，其通透化处理步骤可能在交联后效率有限，从而可能增加CUT&RUN的背景噪音。
2. 实验设计
本研究描述了一种MNase-ChIP-seq实验方案，旨在解析对不可修复DSB产生所响应的组蛋白PTMs谱。实验使用酵母菌株JKM139，通过半乳糖诱导HO内切酶表达，在MATa位点诱导产生一个不可修复的DSB。为了确认组蛋白PTMs的变化是特异地由DSB形成所诱导，将携带HO识别序列突变（MATa-inc）的同源对照菌株JKM139 MATa-inc作为对照，该突变可防止MATa位点被切割。该实验设计如图1所示。
JKM139及其对照菌株在含棉子糖的丰富培养基中生长，在指数生长期（时间0）加入半乳糖以诱导HO表达。在时间0及加入半乳糖后的不同时间点收集样本，以评估HO表达和DSB形成效率，并进行MNase-ChIP-seq。随后，用甲醛交联细胞，用甘氨酸淬灭。提取染色质并用MNase消化，主要获得单核小体和二核小体片段。使用识别特定组蛋白PTM（如H3K79me1）的抗体或针对总组蛋白（如H3）的抗体，对同一样本进行平行免疫沉淀。最后，纯化免疫沉淀样本和输入样本中的DNA，通过下一代测序（NGS）分析，并使用已建立的开源生物信息学流程处理所得序列。
3. 实验流程
为突出关键步骤和质量控制，本方案分为四个主要部分：（i）酵母细胞生长与DSB诱导；（ii）HO表达与切割效率评估；（iii）染色质免疫沉淀；（iv）DNA测序与数据分析。整个流程概览如图2所示。
3.1. 酵母细胞生长与DSB诱导
细胞在YEPD培养基中预培养，之后在YEPR培养基中生长12-16小时。在指数生长期，将细胞稀释至指定浓度，取出未诱导的对照样本（时间0），然后向剩余细胞培养物中加入半乳糖（终浓度3%）以诱导HO表达。在加入半乳糖后的所需时间点收集样本。样本收集的具体流程如图3所示，图中展示的体积代表两次染色质免疫沉淀反应。
3.2. HO表达与DSB形成的评估
3.2.1. HO表达评估
从未诱导培养物（时间0）和HO诱导后的每个实验时间点，收集部分细胞培养物用于RNA纯化。通过RT-qPCR分析评估HO的表达水平。使用的引物对见表1，以ACT1作为内参基因。
3.2.2. HO切割效率评估
从时间0样本和HO诱导后的每个时间点，收集部分细胞培养物用于基因组DNA提取和qPCR分析。通过使用特异性引物对（HO+和HO-）对MATa位点两侧进行qPCR，并以另一个未被切割的基因座（KCC4）作为内参，来评估DSB形成效率。该分析原理如图4所示。
3.3. 染色质免疫沉淀
3.3.1. 交联、淬灭与细胞沉淀制备
从每个时间点的培养物中取出大部分用于质控分析后，向剩余培养物中加入甲醛（终浓度1%）进行交联反应10分钟。之后加入甘氨酸（终浓度0.33 M）淬灭5分钟。细胞沉淀用冷PBS清洗两次，随后在液氮中速冻并储存于-80°C。
3.3.2. 细胞裂解与MNase消化
将细胞沉淀重悬于含蛋白酶抑制剂的ChIP裂解缓冲液中，用玻璃珠破碎细胞。收集裂解上清，将其分为四份进行MNase消化反应，并保留一部分作为未消化的阴性对照。向每个消化样品中加入含有Ca2+的MNase消化缓冲液和MNase酶，在37°C下孵育15分钟。随后加入EDTA终止反应。消化样本在-80°C下保存，直至完成消化质量检查。
3.3.3. MNase消化质量检查
取部分消化样本和未消化对照，进行反向交联反应，随后通过快速乙醇沉淀法提取DNA。将等量的总DNA上样至1.5%琼脂糖凝胶电泳，以检查片段大小。成功的MNase消化应在凝胶上产生明显的单核小体条带（约150-200 bp），随后是二核小体和三核小体条带。应避免过度消化或消化不足。图6展示了典型的MNase消化检查结果。
3.3.4. 染色质免疫沉淀
从-80°C取出经消化质量检查合格的样品，在冰上解冻。将消化后的染色质样品分装，直接加入一抗（如抗H3K79me1或抗H3抗体），在4°C下旋转孵育12-16小时。同时，用PBS和ChIP裂解缓冲液多次洗涤Protein A/G磁珠。随后将抗体-染色质复合物与洗涤后的磁珠混合，在4°C下孵育1小时，使抗体与磁珠结合。
3.3.5. 洗涤与DNA洗脱
在磁力架上收集磁珠，弃上清。依次用以下冰冷的缓冲液洗涤磁珠：ChIP裂解缓冲液（两次）、高盐洗涤缓冲液（两次）、LiCl洗涤缓冲液（一次）和TE缓冲液（两次）。最后，用洗脱缓冲液在室温下洗脱与磁珠结合的DNA。
3.3.6. 反向交联与RNase处理
对免疫沉淀洗脱的DNA样品和输入对照样品进行反向交联和RNase A处理，以去除RNA。
3.3.7. DNA纯化
使用硅胶离心柱商业试剂盒纯化DNA，并用无RNase/DNase水洗脱。测定DNA浓度，随后可用于文库制备。
3.4. DNA测序与数据分析
纯化后的DNA用Qubit 2.0荧光计定量，使用Ovation?Ultralow V2 DNA-Seq文库制备试剂盒构建测序文库。文库质量和浓度用Qubit和HS DNA生物分析仪芯片进行评估。最终在NovaSeqX Plus平台上进行双末端测序。
数据分析遵循标准流程，使用了多种工具。首先，用FastQC评估原始测序读段质量，并用Trim Galore!去除接头和低质量碱基。使用BWA将质控后的读段比对到酿酒酵母参考基因组。随后，用Picard标记并去除PCR重复，用SAMtools过滤掉未比对、非主要比对和低质量比对（MAPQ < 6）的读段。接着，用BEDTools生成标准化的BigWig轨道（每百万比对读段标准化），以便在IGV等基因组浏览器中可视化。使用MACS2进行peak calling。最后，通过featureCounts提取peak内的读段计数，并使用R语言中的DESeq2包进行主成分分析等下游分析。整个分析流程使用MultiQC生成汇总报告。所用工具汇总见表5。
3.5. 故障排除
MNase-ChIP-seq工作流程涉及多个步骤，其中许多步骤需要根据具体试剂和实验目标进行调整。文章在表6中列出了实验过程中可能遇到的常见问题及其潜在解决方案，例如交联效率、MNase消化、抗体特异性、DNA得率低、测序文库质量等问题。
4. 预期结果
该研究通过分析异步细胞中HO诱导的不可修复DSB周围组蛋白H3第79位赖氨酸（H3K79）的甲基化，验证了MNase-ChIP-seq方案的有效性。H3K79的单甲基、二甲基和三甲基修饰由进化上保守的Dot1甲基转移酶催化，已知参与酵母和哺乳动物的DSB信号传导和修复。
如图5所示，RT-qPCR分析证实，在加入半乳糖3小时后，JKM139和JKM139 MATa-inc细胞中的HO表达量相比未诱导条件增加了20-30倍。qPCR分析进一步确定，JKM139细胞在加入半乳糖3小时后，MATa位点的HO切割效率达到98%，而对照菌株JKM139 MATa-inc的切割效率约为0%。
如图6所示，MNase处理15分钟后，在琼脂糖凝胶电泳中产生了以单核小体片段（约150 bp）为主的消化模式，并伴有少量二核小体和更大片段，且所有样本的消化模式相似，表明消化成功，可进行后续ChIP-seq。
对MNase消化后的样本分别用抗H3K79me1和抗H3抗体进行免疫沉淀，随后进行DNA纯化和测序。通过分析HO切割位点着丝粒近端区域（染色体III，191,204至197,270 bp）的读段富集情况，验证DSB形成是否导致H3K79me1的积累。如图7A所示，在HO诱导3小时后，野生型JKM139菌株在染色体III目标区域的H3K79me1/H3相对比率高于突变型JKM139 MATa-inc菌株。而在染色体VIII上一个不相关的对照区域，两株菌的H3K79me1/H3比率相当（图7B）。这些结果表明，DSB的形成导致H3K79单甲基化在断裂左臂至少8 kb范围内特异性富集。
5. 讨论
本文提出了一个稳健的MNase-ChIP-seq方案，旨在绘制酿酒酵母中单个不可修复DSB诱导后的全基因组组蛋白PTMs图谱。该系统依赖于HO内切酶的诱导表达，可在特定位点高效产生一个持久的DSB。该断裂的稳定性为监测DSB修复过程中通常高度动态的组蛋白PTMs的积累、移除和时间演变提供了有利条件。通过结合MNase消化、ChIP和NGS技术，该方案能够详细分析DSB周围的组蛋白PTMs。重要的是，它可以轻松地与监测同一位点单链DNA生成或DNA修复及检查点蛋白招募的互补方法相结合，从而直接将组蛋白PTMs动态与DSB信号传导、加工及最终修复相关联。
除了分析组蛋白PTMs，该方案的灵活性也使其适用于研究非组蛋白染色质结合蛋白的结合，前提是有合适的抗体。通过选择最合适的染色质片段化策略——用于核小体分辨率谱图的MNase消化，或用于更异质性染色质背景的超声处理，该工作流程可适用于研究DNA修复蛋白、转录因子和染色质重塑子在DSB位点或全基因组范围内的招募。此外，由于许多参与DNA损伤响应的蛋白质自身也会发生PTMs，使用识别这些蛋白质特定修饰形式的抗体，可以揭示这些修饰在断裂处或周围的存留及其动力学，为DNA损伤响应的调控提供更多见解。该方案具有高度通用性，可适应不同的酵母遗传背景、替代的基因组位点，或其他核酸酶（包括可修复的DSB）产生的断裂。它支持跨突变体或应激条件的比较研究，并可通过增加分析的抗体数量或时间点来扩展，从而提供DNA损伤响应过程中组蛋白PTMs出现和扩散的动态视图。总之，该系统为解析DNA断裂处的染色质重塑以及将组蛋白PTMs与DSB加工和检查点控制联系起来提供了一个强大的框架。
