《Carbohydrate Polymers》：Virus-inspired
Ganoderma lucidum polysaccharide-functionalized adjuvant with pseudo-zwitterionic interface for potentiated nasal immunization
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鼻腔疫苗递送系统研究开发及免疫增强机制分析。采用灵芝多糖（GLP）修饰的病毒启发型 hybrid nanoparticle（GHNP）平衡粘附与穿透，优化质量比1:24后，显著提升抗原摄取（巨噬细胞25倍，树突状细胞79倍）及免疫应答（sIgA 1.5倍，IgG 1.6倍），建立模块化双功能纳米平台。
Xu-Han Liu|Zhe Zhai|Ling-Ling Tao|Nan-Yu Chen|Yong-Xian Cheng
中国广东省中医药成分与肠道微生物组学重点实验室，深圳大学医学院药学院马歇尔生物医学工程研究所，深圳市，518055，中国。
摘要
鼻内接种在预防呼吸道感染方面具有潜力，但受到黏液屏障的阻碍。为了解决黏附-穿透的难题，我们通过将阳离子聚合物/脂质核心（HNP）与灵芝多糖（GLP）功能化，开发出一种受病毒启发的混合纳米颗粒（GHNP）。通过调节GLP的表面修饰密度，GHNP实现了黏液相互作用和穿透的平衡，最佳GLP与HNP的质量比为1:24。优化后的GHNP(1/24)（约104纳米，+27毫伏）通过其模拟病毒的伪两性界面显著增强了黏液穿透能力。这使得树突状细胞中的抗原摄取增加了79倍，巨噬细胞中的抗原摄取增加了25倍。在小鼠鼻内免疫模型中，GLP通过TLR2/4激活介导的固有免疫刺激活性进一步增强了免疫反应，引发了强烈的黏膜和系统性免疫反应。具体而言，GHNP(1/24)使支气管肺泡sIgA增加了1.5倍，血清IgG增加了1.6倍，同时保持了IgG1/IgG2a的平衡比例。这项工作建立了一个模块化平台，将结构仿生学和碳水化合物免疫工程结合起来，提供了一种可调的双功能策略，用于先进的黏膜疫苗设计，超越了传统递送系统通常只能解决黏附或免疫刺激中某一问题的能力。
引言
全球COVID-19大流行突显了疫苗在抗击传染病中的关键作用（Forni等人，2021年；Pollard & Bijker，2021年）。虽然目前的肌肉注射疫苗（包括灭活病毒和mRNA平台）能有效缓解严重后果（Dooling等人，2020年；Doroftei等人，2021年），但它们无法阻止SARS-CoV-2的传播，因为系统免疫诱导未能充分保护呼吸道病毒的主要入口——鼻黏膜。这一差距凸显了鼻内免疫的变革潜力，鼻内免疫可以在感染部位产生分泌型IgA（sIgA），从而早期拦截病原体。除了更好的黏膜保护外，鼻内疫苗还具有无需注射和成本效益高的实际优势（Afkhami等人，2022年；Miquel-Clopés等人，2019年）。然而，目前FDA批准的鼻内疫苗（例如减毒活疫苗（Harris，2023年；Nigwekar等人，2018年）存在固有的安全风险，这迫切需要更安全的亚单位平台（Huang等人，2022年；Xu等人，2023年）。这些候选疫苗面临严峻的鼻部屏障：由带负电荷的黏蛋白糖蛋白组成的动态网状结构（Jia等人，2015年；Lobaina Mato，2019年）以及黏液纤毛清除机制共同阻碍了抗原进入鼻相关淋巴组织（NALT）——这突显了创新佐剂技术的必要性。
鼻黏膜独特的结构和免疫学特性限制了许多为肌肉注射或皮下注射设计的疫苗佐剂的适用性。鼻黏膜佐剂大致可分为两类：免疫刺激佐剂和基于递送系统的佐剂（Nian等人，2022年）。虽然免疫刺激佐剂（如细胞因子）可以有效地激活鼻黏膜中的局部免疫反应，但它们往往缺乏将抗原穿过黏液层的能力。相比之下，基于递送系统的佐剂不仅有助于抗原穿过黏膜屏障，还具有固有的免疫刺激特性（Bai等人，2024年）。然而，克服黏液屏障需要精确平衡黏附和穿透性能，这对这些递送系统的表面特性提出了严格要求。
当前的策略通过两种不同的方法来解决黏膜递送问题：阳离子载体可以改善黏膜黏附，但会阻碍穿透（Nakahashi-Ouchida等人，2018年；Shim & Yoo，2020年；Singh等人，2018年；Tian等人，2025年；Xiang等人，2024年），而阴离子系统则能增强穿透能力，但会导致快速清除（das Neves等人，2020年；Lai等人，2009b年）。这种根本的权衡源于表面特性的冲突，单一机制的优化无法实现有效的黏膜免疫。病毒通过层次化的表面工程展示了自然界在突破黏膜屏障方面的进化智慧。它们的结构采用功能性分区：一个基因稳定的包膜包裹着病毒负载，而外部糖基化蛋白刺突协调与宿主的动态相互作用。富含精氨酸/赖氨酸等碱性氨基酸残基的阳离子表面区域（Amon等人，2014年；Banerjee & Mukhopadhyay，2016年；Honigfort等人，2021年）通过静电作用与黏蛋白上的唾液酸/硫酸基团结合，形成短暂的黏附“立足点”。同时，阴离子糖基化微域（糖蛋白末端的羧基化/硫酸化残基）通过静电排斥防止与带负电荷的黏蛋白区域发生不可逆黏附（Lai等人，2009a年；Lai等人，2009b年）。这种适应性的功能性两性界面建立了力的平衡：阳离子区域通过静电锚定实现局部黏蛋白黏附，而阴离子基序推动纳米颗粒在黏液层中的定向移动。这种进化优化的机制使病毒能够动态协调界面相互作用，有效穿透黏液屏障。
受病毒进化策略的启发，我们开发了一种仿生佐剂系统（GHNP），通过核壳结构在黏附和穿透功能之间实现了空间分离。设计机制包括三个关键功能组件：（1）由聚乙二醇-聚ε-己内酯（PEG-PCL）和1,2-二油酰-3-三甲铵丙烷（DOTAP）组成的阳离子HNP核心，通过与带负电荷的黏蛋白的静电相互作用提供初始黏膜锚定，模仿病毒的阳离子区域；（2）表面锚定的阴离子灵芝多糖（Harhaji Trajkovi?等人，2009年；Huang等人，2010年；Liu等人，2016年；Paterson，2006年），通过电荷平衡形成伪两性界面，实现类似病毒糖基化区域的受控黏液穿透；（3）GLPs的固有免疫调节特性，作为病原体相关分子模式（PAMPs），被抗原呈递细胞（APCs）上的Toll样受体（TLR2/4）识别，提供内置的佐剂活性（Gao等人，2020年）。这种集成设计通过建立动态相互作用平衡，解决了黏附-穿透的矛盾，其中阳离子核心提供临时黏膜附着，而阴离子GLP区域促进在黏蛋白网络中的定向移动。
GLP的选择基于其双重功能：既作为结构修饰剂，也作为免疫刺激剂。与主要依赖黏附的传统壳聚糖基载体不同，我们的GHNP平台实现了功能的空间分离——HNP核心负责黏膜锚定，而GLP表面修饰同时促进穿透和免疫激活。这种仿生方法反映了病毒的黏附-穿透双重特性，并比现有系统具有显著优势，包括简化制备、提高可重复性和集成佐剂功能。我们假设通过精确控制GLP表面修饰密度，可以优化这种伪两性界面，解决鼻内接种中的基本黏附-穿透难题。
在本研究中，系统地进行了GLP的提取、纯化和结构表征。随后，利用体外模拟黏液层的Transwell实验对GLP表面修饰密度进行了全面筛选，以量化抗原穿透效率，并结合计算建模方法优化了GLP功能化方案。随后在小鼠模型中的体内研究表明，GHNP显著增强了IgG和sIgA抗体的产生以及细胞因子的分泌，从而证实了其在增强黏膜和系统性免疫反应方面的有效性（图1）。
材料
灵芝（由中国科学院微生物研究所鉴定）来自中国云南省楚雄彝族自治州大姚县。聚乙二醇5k-聚ε-己内酯13k（PEG5k-PCL13k）、荧光素异硫氰酸酯标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）和花青素5.5标记的牛血清白蛋白（Cy5.5-BSA）购自广州伟华生物技术有限公司（中国广东）。1,2-二油酰-3-三甲铵丙烷
GLP的表征
分离和纯化后，GLP的产率为原始灵芝粉末的0.03%。通过凝胶渗透色谱法（GPC）分析了GLP的分子量分布。保留时间与分子量的校准曲线符合方程Log?Mw?=?8.369–0.2368?t?1（R2?=?0.9998）。如图2A和B所示，GLP的保留时间为17.68分钟，重量平均（Mw）和数平均（Mn）分子
结论
总之，我们开发了一种用于鼻内接种的病毒启发型混合纳米颗粒佐剂（GHNP）。通过GLP的表面工程，GHNP在黏膜穿透和免疫激活之间实现了最佳平衡。优化后的GHNP(1/24)增强了黏膜穿透，并强烈诱导了黏膜和系统性免疫反应，证明了其作为鼻内疫苗佐剂平台的潜力。与传统黏附剂或纯阳离子系统相比，
CRediT作者贡献声明
Xu-Han Liu：撰写——原始草稿，监督，概念构思。Zhe Zhai：项目管理，方法学，数据管理。Ling-Ling Tao：方法学，数据管理。Nan-Yu Chen：方法学，数据管理。Yong-Xian Cheng：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32500829，82030115）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515110428，2025A1515012065）、深圳市医学研究基金（D2401001）和深圳市科技创新计划（JCYJ20240813142059020）的财政支持。我们感谢中国科学院昆明植物研究所的Wu Mingyi教授提供的技术支持。
