螺旋藻生物质声学指纹图谱的建立：基于超声传播参数的实时生长监测与定量评估

《Current Research in Biotechnology》：Acoustic signatures of microalgal growth: ultrasonic velocity and attenuation as quantitative biomass indicators in Spirulina maxima

针对微藻生物质实时定量监测困难、传统方法侵入性强等问题，本文研究了利用低功率超声波（1?MHz）监测螺旋藻生物质生长。通过14天培养及浓度稀释实验，系统测量了声波速度与衰减系数，发现其与OD680呈现强相关性（速度r=0.93，衰减r=0.97）。研究表明，超声波可作为无损、灵敏的实时生物质定量工具，为光生物反应器过程控制与自动化监测提供新策略。

　　

在当今的食品、饲料、生物制药和生物燃料工业中，微藻已成为不可或缺的生物资源，推动着大规模养殖系统的全球性扩张。然而，随着生产规模的扩大，一个关键问题日益凸显：如何快速、无损地对微藻生物质进行高时间分辨率的量化？这不仅关乎生物过程控制的效率，也影响着生态监测的准确性。传统的生物质定量方法，如重量分析、细胞计数、叶绿素分析和光学密度（OD）测量，都存在固有的短板——它们通常需要取样并进行离线处理。这种“打扰式”监测不仅会中断培养的动态过程，在光学方法应用于高密度培养物时，还会因色素干扰、非线性散射和光程限制等问题而“力不从心”，难以胜任工程化光生物反应器和天然水体的实时监测任务。那么，是否存在一种方法，能够穿透浑浊介质，实现连续、无创的原位测量呢？

这正是《Current Research in Biotechnology》期刊上，由Darmawan Hidayat及其同事所开展的研究试图回答的核心问题。他们将目光投向了超声波传感，这项技术因其“标签自由”、无创的特性，以及在穿透高密度光学介质和提供连续原位测量方面的明显优势，成为一种极具潜力的解决方案。特别是，低功率超声波能够评估声学参数，主要是声速和衰减系数，这些参数对悬浮颗粒、有效压缩性和粘弹性特征非常敏感。尽管已有研究表明，在微藻和微生物悬浮液（如小球藻、赤潮藻和细菌发酵）中，声速会随生物质增长增加约2-10%，但大多数研究集中在终点浓度测量或单相观测，未能系统捕捉不同生长阶段声学特性如何随时间演化。特别是对于像极大螺旋藻这类具有细长形态和胞外基质的丝状蓝细菌，其声学响应更为复杂，缺乏系统的、时间分辨的声学研究将其声学特征与培养过程中的多相生物质发育联系起来。

为了填补这一空白，该研究系统性地评估了在14天的极大螺旋藻培养过程中以及受控的生物质稀释条件下，声速和衰减如何演变。研究人员使用一个经过校准的1?MHz透射系统，量化了超声波传播参数，并将其与光学密度相关联，旨在阐明延迟期、指数期和准稳态生长阶段下微藻悬浮液的声学响应，量化声速和衰减随浓度的变化，并建立基于回归的预测框架用于实时生物质监测。研究结果不仅为理解声学-生物质相互作用提供了基础见解，也为将超声波作为水产养殖和生物工艺工程中的无损生物传感工具奠定了基础。

为开展此项研究，作者们主要运用了几个关键技术方法。首先，建立了完整的超声波测量系统，核心是一个工作频率为1?MHz的透射式超声装置，由脉冲发生器、一对相同的超声换能器、信号放大器和数字存储示波器组成，用于精确测定声波在培养液中的飞行时间和信号幅度。其次，采用光学密度测定法作为生物质生长的参照标准，在680?nm波长下，使用可见光分光光度计每日测量培养物的光密度，以建立时间进程曲线。在数据分析方面，针对浓度梯度实验，每个浓度点的声速和衰减测量均重复十次，结果以算术平均值±样本标准差表示，并对声学参数与光学密度之间进行了强相关性分析和回归模型建立。

研究结果揭示了以下关键发现：

3.1. 微藻生长对声速和声衰减的影响

通过测量0-100% (v/v)浓度梯度的悬浮液，研究发现了声学参数对生物质浓度的明确依赖关系。声速随浓度单调增加，在整个范围内呈现非线性、浓度依赖的行为（R²=0.96），而衰减在低生物质水平时呈现近线性依赖，在较高生物质水平时表现出明显的非线性（R²=0.93）。在100%的藻悬液中，衰减值比纯水高出一个数量级以上，反映了高密度微藻种群引起的显著散射和吸收。

3.2. 声速的时间演变

在14天的培养期内，培养液中的声速从约1507 m/s持续增加至1710 m/s，净增长约13.5%。680)."> 初期变化微小，第5-10天增长加快，尽管此阶段OD₆₈₀显示净生物质积累有限，但声速的持续上升表明，超声波传播不仅对生物质量敏感，也对培养物内部的微结构和物理化学变化（如丝状重组、胞外聚合物产生）敏感。

3.3. 衰减系数的时间演变

衰减系数也从初始的0.0035 dB/cm显著增加至第14天的0.0074 dB/cm，增幅约为111%。第5-11天期间出现了更急剧的上升，这与最高的生物质积累和由细胞密度增加驱动的散射增强时期相对应。第12天后增长速度放缓，反映了向稳定期生长的过渡。

3.4. 通过680 nm光密度评估生长动力学

OD₆₈₀的时间曲线揭示了一个多相生长模式：初始指数期（0-2天）急剧上升，随后是一个漫长的准静止期（2-10天），OD值波动很小，之后在大约第10天后，培养物显示出新的生物质积累，进入二次生长期。这表明在分批培养条件下，极大螺旋藻的生长具有动态性。

3.5. 超声波参数与光学密度的相关性

研究建立了声学参数与OD₆₈₀之间的强经验相关性。680) during 14-day cultivation of S. maxima: (a) sound velocity and (b) attenuation coefficient plotted as functions of OD₆₈₀."> 声速与OD₆₈₀的相关系数r=0.93，衰减系数与OD₆₈₀的相关系数r=0.97。分析显示，声速和衰减对生物质积累的响应存在双相性，早期（0-2天）和后期（2-14天）呈现出不同的线性回归关系，斜率变化反映了从简单细胞增殖到结构生化成熟的转变。声速主要反映整体压缩性和密度，而衰减对散射中心和粘性损耗机制更为敏感。

结论与讨论部分对全研究进行了归纳，并强调了其重要意义。本工作证明，1 MHz低功率超声波为量化极大螺旋藻培养物中的微藻生物质提供了一种精确、无创的方法。在14天的培养过程中，声速和衰减均表现出强烈且浓度依赖性的响应，分别相对于初始值增加了约13.5%和100%以上。它们与OD₆₈₀的强相关性证实了声学参数能够可靠地追踪不同生理阶段的生物质积累，从而实现连续的、实时的数据采集，而无需取样或依赖光学通路。多项式和线性回归模型捕捉了支配这些声学变化的弹性和耗散机制，为实时监测应用提供了预测能力。浓度梯度实验进一步验证了声学参数对生物质负载的敏感性。声速在整个浓度范围内持续增加，而衰减在高生物质浓度下因散射增强、粘性损耗以及密集丝状悬浮液中特有的多粒子相互作用而呈非线性增加。在无需中断培养或接触样本的前提下连续获取这些参数的能力，突显了声波传感用于自动化光生物反应器操作的实用优势，包括不间断监测和生长转变的早期检测。这些趋势强调了超声波对培养物物理（密度、压缩性）和结构（丝状组织、EPS生产）演变具有双重敏感性。总体而言，研究结果将超声传感确立为一种强大的工具，可用于工业微藻系统中的连续生物质追踪、生长期判别和改进的过程控制。所展示的超声测量的准确性、响应性和无创性，使该技术成为集成到自动化光生物反应器平台和环境监测技术中的有力候选方案。