《Free Radical Biology and Medicine》：lncRNA-Driven Multi-omics Reconstitution Engineers EVs for Macrophage-Targeted and Anti-Inflammatory Therapy in MASLD
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本研究提出基于lncRNA多组学重构的外泌体工程策略，通过过表达lncENAF增强HEK293T细胞分泌多功能外泌体（MF-EVs），其靶向肝巨噬细胞并显著改善高脂饮食诱导的MASLD小鼠炎症和肝损伤。该策略突破传统单点增强模式，为复杂网络疾病治疗提供新范式。
林刘|郭恩莉|何卓妍|孙玉龙|焦子明|钟佳丽|王刚林|王凯哲|李伟
中国教育部实验室医学重点实验室，浙江省医学遗传学重点实验室，温州医科大学实验室医学与生命科学学院，温州，325035，中国
摘要
细胞外囊泡（EVs）能够包裹并递送多种生物活性物质，实现多分子间的并行通信和网络级调控，正成为有前景的纳米治疗手段。然而，现有的工程策略主要集中在单一功能的增强上，限制了多维度调控的协同改进。作为概念验证，我们提出了一种基于lncRNA的多组学（转录组学和蛋白质组学）重组的EV工程策略，该策略利用协同功能增强作用，生成具有靶向肝巨噬细胞和抗炎活性的多功能EVs（MF-EVs），用于治疗与代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（MASLD）。以HEK293T细胞作为底盘细胞，过表达lncENAF可重新编程细胞状态，并使EV产量增加40%。蛋白质组学和miRNA测序分析表明，这些MF-EVs富含参与炎症调控和脂质代谢稳态的关键分子网络。体外和体内研究证据表明，MF-EVs能够高效、选择性地递送到肝巨噬细胞，发挥强大的抗炎作用，并减少促炎介质的释放。功能上，MF-EVs显著改善了高脂饮食诱导的MASLD小鼠的肝脏炎症和组织病理损伤。与传统的单点增强方法不同，我们的方法将lncRNA视为系统级的输入，以实现产生细胞及其EVs的内源性、多维度重组，为针对复杂网络疾病的EV疗法建立了工程途径和概念基础。
引言
与代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（MASLD）其特征是肝脏脂质代谢紊乱和慢性低度炎症，其中巨噬细胞在炎症放大、组织损伤和修复重塑中起着关键作用[1]、[2]、[3]。精准干预的一个核心挑战是如何以系统为导向地重塑肝脏免疫微环境，并选择性地调节巨噬细胞表型[4]。细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通信的内源性载体，可以包裹蛋白质、脂质和多种核酸，实现细胞和组织间的多分子并行通信和网络级调控[5]、[6]、[7]。与传统单分子干预（如小分子或重组蛋白）相比，EVs可以通过多物质、多途径的协同作用，重塑受体细胞的转录组学、蛋白质组学和代谢组学状态，从而具有多功能调控潜力和系统级效应[8]。因此，EVs作为天然纳米治疗剂受到越来越多的关注，具有广泛的转化应用前景[9]。然而，天然EVs存在局限性。来自间充质基质细胞等特化细胞类型的EVs虽然富含治疗成分，但产量低且批次间差异显著，限制了其应用[10]、[11]。相比之下，标准的生产细胞底盘（如HEK-293T）适合大规模培养，但分泌的EVs功能成分有限且靶向性不足。这些限制凸显了需要工程策略来可编程地调节EV的成分组成和靶向行为，以实现系统级的调控和疾病干预。
当前的EV工程方法主要分为两种范式：化学修饰和基因工程[12]、[13]。化学修饰方法（如表面偶联和腔内物质装载）可以快速赋予EVs靶向配体或功能模块[14]、[15]、[16]、[17]，但通常需要多步骤操作，可能破坏膜完整性和力学性能，从而影响囊泡的稳定性和生物活性[18]。此外，这类化学修饰通常只实现单一功能单元，无法实现系统级的多功能控制。基因工程可以通过驱动供体细胞过表达特定膜蛋白来增强特定性能维度，以实现靶向或富集特定miRNAs或蛋白质，从而强化某一信号通路[19]、[20]。然而，大多数基因工程方法仍遵循“单一功能单元增强”的逻辑。对于像慢性代谢炎症这样的网络驱动疾病，单一轴度的增强不足以实现系统范围的治疗控制，也无法同时满足可制造性、货物质量和细胞选择性的要求[21]。这些挑战要求从单点工程转向系统级调控，以诱导供体细胞内源性地产生多功能特性。
EV的成分组成和功能输出是供体细胞稳态和应激反应的外在表现，由中心调控网络的整体状态决定[22]。从这个角度来看，对生产细胞进行系统级重编程作为生物底盘，可以在源头同时优化EV产量、成分谱和功能特性[23]。长链非编码RNA（lncRNAs）是跨越表观遗传学、转录学和转录后层面的关键调节因子，协调染色质重塑、RNA加工和参与货物分类及EV生成的蛋白质网络[24]、[25]、[26]。通过将lncRNAs作为系统级输入，可能可以在细胞层面实现多维度协同作用，从而推动EV生产[28]、质量和靶向性的内源性改善，超越单一功能单元工程的局限性。
在这里，我们提出了一种通过多组学重组生产细胞来制造用于MASLD治疗的多功能EVs（MF-EVs）的概念。该策略利用了我们之前在脂肪肝模型中发现的代谢关键调节因子lncENAF（NONMMUG027912）[29]、[30]。我们的先前研究[专利：ZL202111475085.5]表明，lncENAF与hnRNPF（一种异质核核糖核蛋白）发生物理相互作用，后者通过可变剪接和mRNA稳定化来调控全局转录组变化。通过利用lncENAF-hnRNPF轴，我们实现了细胞分泌机制的系统级功能重组，协同增强了MF-EVs的生产产量和内在治疗潜力（靶向性和抗炎活性）。
使用HEK293T作为底盘细胞，我们过表达lncENAF以重新编程细胞状态并诱导MF-EVs的内源性产生。蛋白质组学和miRNA测序分析显示，这些MF-EVs富含参与免疫炎症调控和脂质代谢稳态的分子网络。体外和体内实验表明，MF-EVs能够高效、选择性地递送到肝巨噬细胞，并发挥强大的抗炎作用。功能上，MF-EVs显著改善了高脂饮食诱导的MASLD模型中的肝脏炎症和组织病理损伤（图1）。与传统的单点增强方法不同，我们的方法将lncRNA视为系统级输入，以实现底盘细胞及其EVs的内源性、多维度重组，为基于EV的复杂网络疾病疗法建立了工程途径和概念基础。
部分摘要
细胞培养
HEK-293T（SCSP-5209，CAS）、RAW264.7（TCM13，CAS）和THP-1（TCHu57，CAS）细胞由中国科学院细胞库（上海）提供。小鼠Kupffer细胞购自北京BeNa细胞库（BNCC340733）。这些细胞系均经过检测确认无污染。HEK-293T和RAW264.7细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；Gemini，美国）和1%...
MF-EVs的制备和表征
基于我们之前的研究，lncENAF调控胆固醇稳态和脂质代谢[29]、[30]，以及lncENAF与hnRNPF结合以调节炎症（图S1），我们通过慢病毒转导（pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-lncENAF）建立稳定的过表达lncENAF的HEK-293T细胞系，并进行嘌呤霉素筛选（5 μg/mL，14天；图2A）。方法学验证包括荧光显微镜观察...
讨论
细胞外囊泡（EVs）作为一种变革性的纳米治疗手段，利用其内源性生物相容性、低免疫原性和生物屏障特性[42]、[43]，能够递送多功能物质（蛋白质、miRNAs、lncRNAs），从而重新编程病理微环境[5]、[6]、[7]。生物工程技术的进步进一步提升了其精确度：间充质干细胞衍生的EVs（MSC-EVs）通过抑制TNF-α/NF-κB信号通路来缓解炎症模型，而miRNA工程化的EVs...
结论
在这项研究中，我们提出了一种利用lncRNA驱动的多组学（转录组学和蛋白质组学）重组底盘细胞的策略，以生成用于治疗MASLD的多功能EVs（MF-EVs）。通过在HEK-293T细胞中过表达lncENAF，我们重新配置了细胞状态，并通过协同功能增强，产生了兼具巨噬细胞靶向性、抗炎活性和代谢调控功能的EVs。作为概念验证，这些MF-EVs...
作者贡献声明
焦子明：监督、正式分析、数据管理。钟佳丽：监督、软件开发、实验设计。王刚林：撰写——审稿与编辑、数据可视化、验证、资源协调、项目管理。王凯哲：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、资金筹集、概念构思。李伟：撰写——审稿与编辑、数据可视化、资源协调、实验设计、资金筹集、正式分析。林刘：撰写——审稿与编辑...
数据可用性声明
本研究的数据可根据合理请求向通讯作者获取。
资助
本工作得到了浙江省自然科学基金（LY24H030007）、国家自然科学基金（82202643、81970753）、浙江省重点学科发展计划（温州医科大学-药学）、宁波市科技创新 Yongjiang 2035 重大项目（编号2024Z183）和宁波市 Yongjiang 人才引进计划（编号2023A-114-G）的支持。
致谢
我们感谢温州医科大学科研中心的优秀咨询和实质性支持。
