《Future Foods》：A multimethodological approach to study chemistry and safety of digested
Locusta migratoria
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为解决可食用昆虫营养评价中化学变化与安全性研究不足的问题，研究人员采用INFOGEST体外消化模型结合RP-HPLC-DAD、NMR代谢组学及细胞生物学技术，系统研究了东亚飞蝗（Locusta migratoria）消化过程中的氨基酸生物可及性、代谢物谱变化及对Caco-2和Raw 264.7细胞的相容性。研究发现其具有良好的氨基酸释放谱和细胞安全性，为全面评估可食用昆虫的营养价值与安全性提供了新的多方法学模型。
随着全球人口增长和对可持续蛋白质需求的激增，可食用昆虫（entomophagy）作为一种高蛋白、低环境成本的替代食物来源，正逐渐走入大众视野，并已被欧盟批准为新型食品（Novel Foods）。其中，东亚飞蝗（Locusta migratoria）便是获准物种之一。然而，公众和科研界在拥抱这一“未来食物”时，心中仍存有不少疑问：这些昆虫宣称的高蛋白含量，我们的身体到底能有效吸收多少？在模拟人体消化过程中，除了蛋白质，还有哪些具有潜在生物活性的物质会被释放出来？更重要的是，消化后的产物对我们的肠道细胞安全吗？目前的研究大多聚焦于昆虫的原始营养成分或单一的蛋白质消化率，缺乏一个能同步揭示其消化过程中化学全景变化与生物安全性响应的综合评估体系。针对这一空白，一篇发表在《Future Foods》上的研究为我们带来了新的见解。
为了全面回答上述问题，来自意大利帕维亚大学的研究团队开展了一项系统性研究。他们并未局限于单一技术，而是创造性地采用了一套“多方法学组合拳”，旨在为东亚飞蝗在消化过程中的表现绘制一幅更精细、更立体的画像。研究者们首先利用国际通用的INFOGEST体外静态消化协议，模拟了东亚飞蝗从口腔、胃到十二指肠的全消化过程。随后，他们运用反相高效液相色谱-二极管阵列检测法（RP-HPLC-DAD）精准定量了消化各阶段的总氨基酸含量（TAAC）与具体氨基酸谱；通过核磁共振（NMR）代谢组学技术，无偏性地捕捉了从有机酸到氮碱基衍生物等各类小分子代谢物的动态变化；同时，他们创新性地引入细胞生物学评估，利用人结肠腺癌细胞（Caco-2）和小鼠巨噬细胞（Raw 264.7）模型，测试了消化前后样品对肠道上皮屏障完整性、细胞活力及形态的影响，从而从生物学角度评估其安全性。此外，研究还优化了微波辅助酸水解技术用于蛋白质前处理，并精确测定了样品中的甲壳素含量，以避免其对蛋白质定量的高估。
主要关键技术方法
本研究采用了多学科交叉的技术路线。1. 体外消化模型：严格遵循INFOGEST标准化静态体外消化协议，模拟口腔、胃、十二指肠三阶段的消化环境。2. 化学成分分析：采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测法（RP-HPLC-DAD），结合优化的微波辅助酸水解，定量分析总氨基酸及单个氨基酸；采用1H 核磁共振（NMR）代谢组学 技术对原料及消化各阶段的提取物进行非靶向代謝物鉴定与定量。3. 细胞生物学评估：使用Caco-2细胞（人结肠腺癌细胞）单层模型评估肠道屏障完整性（通过跨上皮电阻TEER测量）和渗透性；使用Caco-2和Raw 264.7细胞（小鼠巨噬细胞）评估细胞活力与形态（通过共聚焦激光扫描显微镜CLSM和扫描电镜SEM观察）。4. 甲壳素定量：采用基于酶法的乙酸测定试剂盒对样品中的甲壳素进行精确定量。
研究结果
3.1. 甲壳素分离与定量
研究人员通过脱脂、脱矿、脱蛋白及脱乙酰化等预处理步骤，精确测定了商业干燥东亚飞蝗样品中的甲壳素含量为13.19±1.25 g/kg（即约1.32%）。这一测定至关重要，因为它指出通过凯氏定氮法（Kjeldahl method）测定的总蛋白含量（59.75 g/100g）会因包含甲壳素等非蛋白氮而存在高估，凸显了直接测定总氨基酸含量（TAAC）进行蛋白质营养评价的准确性优势。
3.2. 实验设计（DOE）
为优化微波辅助蛋白质酸水解条件，研究采用23全因子设计，考察时间、温度和功率的影响。标准化帕累托图显示，水解时间对总氨基酸含量有显著正影响，温度亦有正影响但不显著，功率则有轻微负影响。最终确定的最佳水解条件为180°C、120分钟、500W，验证实验证实了该模型的可靠性。
3.3. 东亚飞蝗蛋白质暴露对Caco-2和Raw 264.7细胞的影响
细胞相容性实验表明，无论是消化前还是消化后的东亚飞蝗样品，在测试浓度下对Caco-2和Raw 264.7细胞均表现出良好的细胞相容性，未引起细胞毒性。其中，十二指肠相样品在Caco-2细胞中显示出最高的细胞活力。跨上皮电阻（TEER）测量结果显示，与空白对照组相比，十二指肠相样品处理并未引起Caco-2细胞单层屏障完整性的显著变化。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和扫描电镜（SEM）图像进一步证实，细胞单层结构完整、连接紧密，未观察到上皮屏障或单层完整性的破坏。
3.4. 东亚飞蝗蛋白质生物可及性与吸附研究
RP-HPLC-DAD分析显示，原料中总氨基酸含量（TAAC）为49.57±0.80 g/100g，低于标签值（59.9 g/100g）和凯氏定氮结果，再次印证了直接氨基酸定量法的准确性。在模拟消化过程中，氨基酸的释放主要发生在胃相和十二指肠相。不同氨基酸的生物可及性与吸收率差异显著：半胱氨酸（Cys）、丝氨酸（Ser）、赖氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）和苯丙氨酸（Phe）表现出良好的吸收和生物利用度（>90%）；而组氨酸（His）、苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）和谷氨酸（Glu）则显示出有限的生物利用度。蛋氨酸（Met）被检出但未定量，表明其可能是限制性氨基酸。
3.5. NMR代谢组学分析
这是首次将NMR代谢组学应用于东亚飞蝗的研究。该技术不仅追踪了16种蛋白质氨基酸在消化过程中的变化（与HPLC趋势一致），还全面鉴定了包括有机酸（如乙酸、琥珀酸）、氮碱基及其衍生物（如腺苷、尿嘧啶）以及其他代谢物（如甜菜碱、牛磺酸、磷酸胆碱）在内的多种化合物。研究发现，在十二指肠相，乙酸和琥珀酸含量显著增加；具有生物活性的甜菜碱和牛磺酸在整个消化过程中含量均低于原料，提示其可能未完全释放或发生降解；磷酸胆碱在十二指肠相显著增加，可能源于磷脂的降解；海藻糖作为昆虫典型糖类被检出，且在消化过程中含量略有下降。
3.6. 综合讨论
研究结果从多角度提升了人们对东亚飞蝗作为替代蛋白质来源营养价值的认识。首先，强调了甲壳素含量对传统蛋白质测定方法（凯氏定氮法）造成高估的影响，确立了基于总氨基酸含量（TAAC）的分析方法更具准确性。其次，微波辅助酸水解作为一种高效、省时的方法被证明适用于昆虫蛋白分析。再者，NMR代谢组学揭示了东亚飞蝗除氨基酸外丰富的代謝物谱，包括具有潜在生物活性的物质，拓宽了对其营养和功能价值的理解。最后，从细胞生物学角度证实了消化后的东亚飞蝗产物具有良好的生物安全性和细胞相容性，未损害肠道屏障功能。
研究结论与意义
本研究成功构建并应用了一套整合化学分析与生物评价的多方法学模型，首次对东亚飞蝗在模拟消化过程中的化学变化与细胞相容性进行了全面、深入的评估。主要结论包括：1. 东亚飞蝗蛋白质具有较好的氨基酸组成，但不同氨基酸的生物可及性与吸收率存在差异，需在营养评价中予以区分。2. 甲壳素的存在会导致基于氮含量的蛋白质测定结果高估，直接氨基酸定量更为准确。3. 微波辅助酸水解与RP-HPLC-DAD结合是分析昆虫蛋白的有效工具。4. NMR代谢组学能全面揭示昆虫及其消化产物的复杂代謝物组成，发现了多种可能具有营养或生物活性的小分子。5. 细胞实验证实，消化后的东亚飞蝗成分对肠道上皮细胞和免疫细胞无毒性，且不破坏肠道屏障完整性，从生物学层面支持了其食用安全性。
这项研究的核心意义在于，它超越了仅关注蛋白质消化率的传统视角，通过“化学全景扫描”与“生物安全应答”双管齐下的策略，为可食用昆虫的营养价值与安全性评估提供了一个更为严谨、全面和创新的方法论框架。它不仅增进了我们对东亚飞蝗这一特定物种在消化过程中复杂行为的科学理解，其建立的多方法学模型也可推广应用于其他可食用昆虫的系统性评价，从而为推动昆虫蛋白这一可持续未来食物的科学认知、标准制定和公众接受度提升，提供了重要的数据支撑和评估工具。
