《International Journal of Biological Macromolecules》：Synergistic regulation of directional structure of hydrogel and mechanical stimuli on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells
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该研究在穿山龙中鉴定并表征了两个黄酮类化合物合成关键酶基因ThF3H1和ThF3H2，揭示其亚细胞定位差异（ThF3H1胞质，ThF3H2胞质/核）、催化特性及在盐胁迫响应中的关键作用，并解析了四个关键催化位点。
姜志岩|刘俊尧|邵彩华|王思颖|徐娟|王颖|林晓宇|徐海顺|吴学谦
国家森林食品资源开发利用重点实验室，浙江省特色中药材资源保护与创新利用重点实验室，灵芝和三叶青产业国家创新联盟，浙江农林大学食品与健康学院，杭州，311300，中国
摘要 Tetrastigma hemsleyanum （Diels et Gilg）中的黄酮类化合物对植物的应激反应至关重要，但其生物合成途径和调控机制仍知之甚少。本研究鉴定并表征了T. hemsleyanum 中的两个黄酮-3-羟化酶（F3H ）基因ThF3H1 和ThF3H2 ，它们属于2ODDs-DOXC28亚家族。组织特异性表达分析显示，这两个基因在块根中高度表达，并表现出不同的应激反应模式。序列和系统发育分析证实，这些基因含有2ODD家族的典型结构域，并与多种植物物种的F3H蛋白密切相关。亚细胞定位研究表明，ThF3H1 主要位于细胞质中，而ThF3H2 同时存在于细胞质和细胞核中。体外酶活性测定表明，这两种酶都能将柚皮苷转化为二氢山柰酚和少量阿皮苷，其中ThF3H2 的催化效率更高（k_cat /K_m = 0.0093 s-1 ·μM-1 ）。AlphaFold2预测和分子对接分析揭示了ThF3H1 与其底物的结合模式。定点突变进一步确定了四个关键催化残基（Glu122、Lys196、Lys326和Asp330）。此外，这两个基因在盐胁迫下显著上调，其异源表达增强了大肠杆菌 的耐盐性，这突显了它们在植物应激反应中的关键作用。这些发现加深了对植物F3H功能的理解，并为提高T. hemsleyanum 的质量和抗逆性提供了分子基础。
引言 植物在漫长的进化过程中发展出了复杂的次级代谢网络，以适应各种环境胁迫。其中，黄酮类化合物在植物应激反应中起着重要作用。黄酮-3-羟化酶（F3H）是黄酮类化合物生物合成中的关键酶，已被证实是这一过程中的重要调控因子。近期研究逐渐阐明了F3H基因在不同物种应激反应中的作用。例如，Song等人[1]表明，在Lycium chinense 中过表达F3H 显著提高了转基因烟草的耐旱性，其机制涉及抗氧化系统的激活和过氧化氢水平的降低[1]。在耐寒性研究中，Wu等人报告称，在T. hemsleyanum 中过表达ThF3H 通过促进黄酮类化合物的积累提高了拟南芥 的耐寒性[2]。Mahajan和Yadav[3]发现，在Camellia sinensis 中过表达CsF3H 增加了转基因烟草中的黄酮-3-醇含量，并提高了其耐盐性[3]。此外，Liu等人[4]观察到，在沙漠植物Reaumuria soongorica 中，UV-B辐射和干旱胁迫诱导了RsF3H 基因的上调，伴随着黄酮类化合物和花青素含量的增加[4]。F3H还参与了对氧化应激的反应[5]。总体而言，这些研究表明F3H在植物耐逆机制中具有多功能性。
从分子进化的角度来看，F3H属于2-氧代戊二酸依赖性双加氧酶（2ODD）超家族。作为植物基因组中第二大酶家族，2ODDs催化多种氧化反应，包括羟基化、去甲基化、反式-顺式异构化、重排、卤化和环裂解[6]。根据序列相似性，植物2ODD家族进一步分为三个进化亚家族：DOXA、DOXB和DOXC[7]。其中，参与黄酮类化合物生物合成的成员分为两个分支：DOXC28（包括F3H和FNSI）和DOXC47（包括FLS、ANS和DFR）[7]。早期关于黄酮类3′-羟化酶（FNSI）的研究主要集中在伞形科植物和单子叶植物上[8]、[9]。F3H的酶活性首次在Antirrhinum majus 中被报道，其中F3H的突变阻断了花青素的生物合成途径[10]。随后，从Petunia hybrida 、Malus （苹果）、Vitis vinifera 和Carthamus tinctorius 等物种中克隆并鉴定了F3H基因并研究了其功能[11]-[14]。这些研究表明，FNSI可能是通过基因复制从F3H进化而来的。F3H催化柚皮苷的3-羟基化，这是黄酮类化合物生物合成途径中的一个关键分支点。在该途径中，p-香豆酰-CoA首先在查尔酮合酶（CHS）和查尔酮异构酶（CHI）的共同作用下转化为柚皮苷，然后由F3H转化为二氢山柰酚（DHK）。DHK随后可以通过黄酮醇合酶（FLS）或二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和花青素合酶（ANS）分别转化为黄酮醇或花青素[5]、[15]。这些酶促反应需要2-氧代戊二酸、Fe2+ 和抗坏血酸作为辅因子。
T. hemsleyanum 是Vitaceae 科中的一种重要药用植物，含有丰富的生物活性次级代谢产物。黄酮类化合物（包括黄酮、黄酮醇、黄酮酮和它们的糖苷）是T. hemsleyanum 的主要活性成分[16]。最近，我们在T. hemsleyanum 的块根中鉴定出两种独特的黄酮糖苷，其结构基于3-羟基柚皮苷或3-羟基阿皮苷，并在C-3位进行了糖基化修饰（未发表的数据）。这一发现促使我们研究了T. hemsleyanum 中黄酮-3-羟化酶（F3H）基因的作用。然而，关于这种植物中黄酮类化合物的生物合成途径和调控机制知之甚少，特别是F3H在应激反应中的作用。在本研究中，我们鉴定并表征了T. hemsleyanum 中的两个F3H同源基因ThF3H1 和ThF3H2 。系统发育和基因结构分析证实它们属于2ODDs-DOXC28亚家族。我们通过组织表达分析、亚细胞定位、体外酶活性测定和定点突变对其生化特性、催化机制和关键功能残基进行了全面分析。结果表明，ThF3H1 和ThF3H2 不仅参与黄酮类化合物的生物合成，还参与植物对盐胁迫的响应，表明它们在植物抗逆性中起作用。这些发现加深了我们对黄酮类化合物生物合成分子机制的理解，并为提高T. hemsleyanum的质量和抗逆性提供了潜在的分子靶点。此外，它们还为二氢黄酮醇与其他黄酮类化合物的合成途径和进化关系提供了新的见解。
实验材料 植物材料 T. hemsleyanum 的幼苗从中国浙江省遂昌县的T. hemsleyanum 种植基地采集，并在浙江农林大学的温室中培养。从种植基地采集时，幼苗已有3个月大。转移到温室后，幼苗在25°C、12小时光照/12小时黑暗的光周期下进行适应和进一步生长，然后进行实验处理。ThF3H1/2的表达模式及其应激反应 F3H 是T. hemsleyanum 中黄酮类化合物生物合成途径中的关键酶，可能在植物的应激反应中起重要作用。先前的研究表明T. hemsleyanum 中存在显著的基因扩增[25]，我们鉴定了六个潜在的F3H基因（图1A）。利用从水分胁迫处理中获得的转录组数据，我们在T. hemsleyanum 的块根中鉴定出两个高表达的F3H基因，即Them08G00403 （ThF3H1 ）和Them14G00614 （ThF3H2 ）。讨论 T. hemsleyanum 因其丰富的次级代谢产物而受到广泛关注，尤其是具有多种生物活性的黄酮类化合物。2-氧代戊二酸依赖性双加氧酶（2ODD）超家族中的DOXC亚家族成员对黄酮类化合物的生物合成至关重要。先前的研究表明，不同植物物种中的同源基因具有相似的结构特征和功能。例如，Park等人[27]通过序列比对证明...
结论 本研究对T. hemsleyanum 中的两个黄酮-3-羟化酶基因（ThF3H1 和ThF3H2 进行了全面表征。我们的发现表明，它们在块根中具有组织特异性表达，并且具有不同的亚细胞定位模式：ThF3H1 主要位于细胞质中，而ThF3H2 同时存在于细胞质和细胞核中。生化分析证实了它们将柚皮苷转化为二氢山柰酚的酶活性，其中ThF3H2 的催化效率高出1.94倍...
CRediT作者贡献声明 姜志岩： 写作——审稿与编辑，撰写初稿，验证，软件使用，资金获取，数据管理，概念构思。刘俊尧： 写作——审稿与编辑，撰写初稿，验证，软件使用，数据管理。邵彩华： 方法学研究，数据分析。王思颖： 资金获取，数据管理。徐娟： 方法学研究，资金获取。王颖： 资金获取，数据分析。林晓宇： 方法学研究，资金获取。利益冲突声明 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢 本工作得到了
浙江省自然科学基金 （项目编号LQN26H280012）、
遂昌县科技计划 （项目编号SCX2025HZ09和SCX2024HZ20）、
浙江省农业科技合作项目 （项目编号2024SNJF035）以及
浙江省自然科学基金华东医学联合基金 （项目编号LHDMY25H010002）的支持。感谢
研究人员之家 （
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