《International Journal of Biological Macromolecules》：Carboxymethyl inulin functionalized gold nanoclusters within a chitosan matrix for biocompatible photothermal and anticancer theranostics
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CMI-GNCs结合IR-820和PfHS实现多模态诊疗与成像，光热治疗诱导癌细胞凋亡并抑制迁移，抗生物膜效果优于单一GNCs，且生物相容性显著提升。
Rounik Karmakar|Kalyani Eswar|Anamika Verma|Sri Amruthaa Sankaranarayanan|Mohammad Sadik Ali|Basu Bhattacharjee|Apoorva Basa|Amit Ghosh|Pramit Kumar Ghosh|Ajinkya Madhukar Thanekar|Bantal Veeresh|Falguni Pati|Aravind Kumar Rengan
印度海得拉巴印度理工学院生物医学工程系
摘要
癌症治疗和生物成像需要改进选择性、疗效和生物相容性。在此，我们开发了壳聚糖接合的、羧甲基化菊粉修饰的金纳米簇（CMI-GNCs），其中含有近红外染料IR-820和Proflavine半硫酸盐（PfHS），旨在增强细胞摄取、生物成像的荧光效果以及光热治疗的疗效。通过动态光散射（DLS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认了不同纳米颗粒配方的稳定性。羧甲基化菊粉显著提高了荧光强度，而壳聚糖则改善了细胞摄取，使CMI-GNCs适用于成像应用。在B16癌细胞上的体外实验表明，ChCGPI纳米颗粒在近红外照射下可达到45°C以上的温度，有效诱导癌细胞的光热消融。克隆生成实验显示癌细胞再生受到抑制，通过线粒体膜电位和核碎片化实验确认了细胞凋亡。抗迁移研究表明ChCGPI减少了癌细胞的迁移能力，表明其具有抗转移潜力。在另一项研究中，我们还评估了CMI-GNCs对抗大肠杆菌（E. coli）生物膜的特性，发现其与单独的GNCs相比具有更强的抗生物膜效果。此外，斑马鱼胚胎实验表明，CMI接合降低了GNCs的毒性，显著提高了其生物相容性。这些发现凸显了CMI-GNCs，特别是ChCGPI，作为多功能平台的潜力，可用于生物成像、靶向光热癌症治疗和改善生物相容性。
引言
黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤癌类型，起源于黑色素细胞，由于其高转移潜力和对传统治疗的耐药性，仍然对人类健康构成重大威胁。尽管手术、化疗、放疗和靶向治疗改善了治疗效果，但仍存在系统性毒性、复发、药物耐药性和对恶性细胞选择性差等局限性，这强调了需要更精确和多功能的治疗策略[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。解决这些局限性需要创新的纳米医学方法，将治疗和成像结合以实现协同效应。纳米技术已成为生物医学研究中的一个有前景的领域，为开发多功能治疗剂提供了机会，这些治疗剂可用于成像、治疗和药物递送[7]、[8]、[9]。其中，光热疗法（PTT）通过将近红外光转化为局部热量来治疗癌症，既能靶向肿瘤又能保护周围健康组织[10]、[11]、[12]。光热纳米材料的高效光吸收使得用相对较低的激光功率就能破坏肿瘤，从而减少对周围健康组织的附带损伤[13]。此外，将PTT与其他治疗方式结合可以进一步提高其疗效，为更全面的癌症治疗提供协同方法[14]。最近的研究表明，光激活的光动力疗法（PDT）可以改变肿瘤微环境的细胞、基质和血管特性，这种现象称为光动力预处理。这些变化可以使肿瘤组织更容易接受后续的化疗或免疫治疗[15]、[16]。
近年来，由于天然多糖的可生物降解性和生物相容性，它们作为纳米载体的应用越来越多。壳聚糖是一种从几丁质衍生出的阳离子聚合物，因其出色的成膜能力、黏附性和封装多种治疗剂的能力而受到关注[17]、[18]。然而，基于壳聚糖的纳米载体在生理pH值下溶解度较低且稳定性有限，这可能阻碍有效的药物递送[19]、[20]。菊粉是一种天然多糖，主要由β(2,1)键连接的果糖单元组成，末端通常是一个葡萄糖单元[21]。由于其益生元特性和能够在上消化道中保持完整，它被广泛用于食品和制药应用，使其成为口服药物递送系统的有希望的候选材料[22]、[23]。此外，研究表明菊粉具有免疫信号传导能力，特别是通过人类免疫细胞上的Toll样受体2（TLR-2）[24]。然而，它缺乏形成稳定纳米颗粒或实现靶向递送所需的功能基团。将菊粉化学修饰为羧甲基化菊粉（CMI）可以引入羧基，显著提高水溶性、稳定性和药物结合潜力，使其成为纳米医学应用中更加多功能的平台[25]。
近年来，在纳米尺度材料的研究方面取得了重大进展，包括簇、纳米簇（NCs）、纳米颗粒、量子点（QDs）和纳米点（NDs），每种材料都具有独特的结构和光物理特性[26]、[27]、[28]。簇是最早研究的类型之一，由小于2纳米的金属原子小群体组成，在催化和自组装方面有广泛的应用[29]。纳米颗粒最初引入药物科学领域，现在涵盖了广泛的尺寸范围（1–100纳米），并在多个学科中得到广泛应用。量子点因其量子限制效应而主要存在于2–15纳米范围内，以其光电应用而闻名。纳米簇通常小于2纳米，代表了关键的发展，结合了簇的特性和量子效应，使其在光学、催化和电子功能方面具有更好的可调性[30]。它们的小尺寸使得纳米簇在生物成像、药物递送和能量转换等领域具有优势，使其成为传统纳米颗粒和量子点的更精细替代品[31]、[32]。尽管有这些优势，但由于对潜在细胞毒性和生理条件下的聚集的担忧，限制了它们的直接临床应用。用CMI等生物相容性聚合物合理修饰GNCs可以提高其胶体稳定性，降低毒性，并增强功能多样性，从而产生新的混合系统，如羧甲基化菊粉修饰的金纳米簇（CMI-GNCs）。这种修饰不仅稳定了纳米簇，还提供了丰富的功能位点用于治疗负载。尽管羧甲基化菊粉（CMI）在化学上具有多样性且具有潜在的生物相容性，但其生物医学应用仍相对较少探索，其作为功能性纳米载体的用途很大程度上尚未得到开发[25]、[33]。因此，在这项研究中，我们报告了CMI增强荧光的能力，这可能为开发更敏感和高效的生物成像剂铺平道路。同时，光热疗法（PTT）作为一种微创方法，通常使用如IR-820等近红外吸收染料进行局部肿瘤消融[34]、[35]、[36]。这种染料具有更深的组织穿透性和高效的热转换能力，但存在光漂白和快速清除的问题，这限制了持续的成像和治疗监测[37]、[38]、[39]。此外，加入如Proflavine半硫酸盐（PfHS）等化疗剂可以增强抗癌效果，但其非特异性毒性仍然是一个挑战。因此，迫切需要设计能够同时递送治疗剂、实现持续荧光成像并产生协同治疗效果的多功能纳米载体[40]。
在这项研究中，我们合成了壳聚糖包覆的、羧甲基化菊粉修饰的金纳米簇（ChCGPI），同时负载了IR-820和PfHS（图1）。该设计利用了壳聚糖的结构优势来提高稳定性，利用CMI的生物相容性和功能性来稳定GNCs，并同时加载光热和化疗剂以实现联合治疗效果。我们的发现表明，这种纳米平台提供了强大的荧光成像、有效的光热转换、增强的活性氧生成以及在体外和体内的显著抗癌效果，凸显了其作为精确、微创黑色素瘤治疗工具的潜力。尽管已经探索了多种用于成像引导的光热治疗的纳米治疗系统，但许多平台在照射后的成像稳定性有限、载荷整合不完全或缺乏抗菌功能。在这方面，我们用CMI功能化的、BSA稳定的金纳米簇提供了稳定的荧光，而壳聚糖则实现了IR-820和PfHS的有效细胞内化及共同递送，从而实现了协同的光热-化疗效果。额外的抗生物膜性能进一步使该系统适用于易感染的肿瘤微环境和治疗后的环境。
材料
牛血清白蛋白（pH：6–7）、氢氧化钠、抗坏血酸、壳聚糖、菊粉、单氯乙酸、三聚磷酸钠（STPP）、结晶紫、MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物从印度SRL Chemicals Limited购买。JC-1染料、BODIPY 581/591 C11试剂从Invitrogen-Thermo Fisher（美国）购买。四氯化金三水合物（HAuCl4.3H2O）、IR-820、Proflavine半硫酸盐（PfHS）、荧光素二醋酸酯（FDA）
结果与讨论
合成了八组纳米制剂——BSA稳定的金纳米簇（GNCs）、羧甲基化菊粉修饰的BSA稳定的金纳米簇（CMI-GNCs）、壳聚糖（Ch）纳米颗粒、壳聚糖包覆的GNCs（ChG）纳米颗粒、壳聚糖包覆的CMI-GNCs（ChCG）纳米颗粒、壳聚糖包覆的CMI-GNCs与PfHS（ChCGP）纳米颗粒、壳聚糖包覆的CMI-GNCs与IR-820（ChCGI）纳米颗粒、壳聚糖包覆的CMI-GNCs与PfHS和IR-820（ChCGPI）纳米颗粒——以进行测试
结论
总之，本研究成功开发并全面表征了一种新型的治疗诊断纳米平台（ChCGPI），该平台由封装了CMI-GNC和IR820及PfHS的壳聚糖纳米颗粒组成。选择CMI作为多糖修饰剂是为了补充BSA稳定的金纳米簇系统，因为BSA提供了丰富的表面暴露的胺（–NH?）基团用于相互作用。在菊粉中引入羧甲基基团生成了高密度的羧酸盐
未来方向
基于本研究的有希望的结果，未来的研究将系统地比较CMI与其他多糖（如海藻酸钠、透明质酸和壳聚糖衍生物）在相同合成条件下的表现，以阐明控制荧光调节的结构-功能关系。此类研究将进一步阐明多糖化学在优化纳米簇稳定性、成像性能和治疗效果中的作用。
CRediT作者贡献声明
Rounik Karmakar：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，软件，项目管理，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。Kalyani Eswar：撰写 – 原稿，软件，方法学，数据管理，概念化。Anamika Verma：撰写 – 原稿，软件，方法学，数据管理，概念化。Sri Amruthaa Sankaranarayanan：方法学，数据管理
写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了大型语言模型（LLM-chatGPT 4o）来提高手稿质量。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全责。
致谢
A.K.R. 感谢ICMR/IIRPIG/2024/02351；MoE/STARS-2/2023-0640；ICMR/FIW-2024-01-00000208；ANRF/SPR/2022/000230提供的财政支持。作者R.K感谢DBT（DBT/2021-22/IIT-H/1715）资助他的奖学金。作者K.E感谢MoE-PMRF（ID 2003331）资助她的奖学金。作者A.V感谢大学拨款委员会（UGC），印度政府。作者S.A.S.感谢MoE-PMRF
