“暗处之光”：非视觉视蛋白（NVOs）的信号机制及其生理功能全景解读

《Annual Review of Physiology》：Light Out of Sight: Signaling Mechanisms for Nonvisual Opsins

这篇综述系统地总结了非视觉视蛋白（Opn3, Opn4, Opn5）的研究进展，聚焦于其光信号转导机制与生理功能。文章阐述了这些在脑和外周器官广泛表达的G蛋白偶联受体（GPCR）如何介导瞳孔对光反射、昼夜节律等生理性光反应，揭示了光调控人体生理的新方式，并对未来研究方向提出了展望。

　　

1. 视蛋白G蛋白偶联受体家族简介

G蛋白偶联受体（GPCRs）是真核生物中最大的信号受体家族。它们通过其七次跨膜（TM）结构域拓扑，将广泛的细胞外信号转化为细胞反应。视蛋白家族属于GPCR，被光子激活，通常作为动物的光传感器。视蛋白利用与第七跨膜域（TM7）中保守赖氨酸残基（在视紫红质中为K296）结合的视黄醛发色团检测光子。光子几乎瞬间使视黄醛异构化（在哺乳动物中从11-顺式变为全反式），导致受体构象变化，从而允许G蛋白结合并启动细胞内信号传导。

视蛋白可分为三个主要基因群：包括杆状和锥状视蛋白的纤毛视蛋白，它们是脊椎动物视觉的主要感光器；包括果蝇视紫红质的杆状体视蛋白，是无脊椎动物的主要视觉色素；以及特征较少的周视蛋白和视黄醛G蛋白偶联受体（RGR）/Go-视蛋白，包括光异构酶，在视网膜色素上皮中表达。哺乳动物物种有八或九种视蛋白。视紫红质（Opn2）和用于蓝、绿、红视觉的三种锥状视蛋白（Opn1）在20世纪80年代被克隆和测序。20世纪90年代末，从大脑中鉴定出哺乳动物视蛋白家族的一个新成员，命名为脑视蛋白或视蛋白3（Opn3）。不久之后，黑视蛋白或视蛋白4（Opn4）通过与非洲爪蟾黑素细胞中感光器的同源性被鉴定出来，几年后，神经视蛋白或视蛋白5（Opn5）从脑互补DNA（cDNA）中克隆出来。由于这三种新的哺乳动物视蛋白家族成员似乎都不是视觉所必需的，因此Opn3、Opn4和Opn5被视为非视觉视蛋白（NVOs）。然而，Opn4的这一分类最近受到挑战，新数据揭示Opn4有助于视觉功能的不同方面。

NVOs在物种间高度保守，表明它们具有生理相关的功能。哺乳动物NVOs与视觉视蛋白的同源性相对较低（15-35%）。所有NVOs共享TM7中的保守赖氨酸。与Opn2相比，所有三种NVOs都具有更长的C末端，其中Opn4最长。所有三种NVOs都是双稳态色素，这一特性使它们能够在不需要额外异构酶的情况下在不同细胞类型中发挥作用，这与它们的广泛组织分布一致。

2. 生理性光照水平

由于阳光在地球生命演化过程中一直存在，所有物种都发展出了检测和响应到达地球表面的太阳波长的机制。我们的眼睛可以看到可见光（~400-750 nm），我们的皮肤响应紫外线（~280-400 nm），我们可以感受到红外辐射（>750 nm）的热量。在哺乳动物中，眼睛曾被认为是唯一能够检测和响应光的器官，但皮肤，尤其是在缺乏含黑色素的毛发但具有表皮黑素细胞的人类中，暴露在与眼睛相同水平的可见光下。此外，光也可以更深地穿透体内。NVOs的发现，即广泛表达的光受体，为研究光调节不同生理过程的许多可能方式打开了大门。

实验研究这些新颖而令人兴奋的光调节机制需要了解所检查的细胞或组织生理上暴露的光照水平。任何波长的过多光线都可能引起非特异性反应，部分原因是产生活性氧。因此，估算整个身体的生理光照水平对于设计和解释实验以及理解NVOs的功能至关重要。

地表的最大太阳辐射量是在中午、赤道、无云的日子里测量的。光和其他形式的辐射既可作为波（以能量通量W/m²量化），也可作为粒子（光子，以光子通量photons/m²/s量化）。中午赤道处每个波长的太阳辐照度（定义为每单位面积的太阳能W/m²）可以作为整个动物可能暴露的最大辐射量的指南。光子通量是实验条件下更合适的测量方法，因为它考虑了辐射的波长。辐照度和光子通量也可以使用不同的在线转换器进行转换。对于暴露于特定波长的情况，总能量（J/m²或photons/m²）可以计算为这些值的时间积分。太阳辐照度和光子通量值随一天中的时间、一年中的时间和测量地点的纬度而变化。皮肤和眼睛接收到的辐照度或光子通量值，但穿透皮肤的光量随深度迅速衰减。大约50年前，测量了光通过猕猴和具有不同色素沉着的猫的眼睑的透射率，发现透射率随波长增加，在400-700 nm范围内，猕猴眼睑透射了整个可见光谱的~2-15%的光，而对于眼睑皮肤有表皮黑素细胞的猫，透射率取决于色素沉着。这些结果对于理解光如何穿透人类皮肤特别相关，人类皮肤与小鼠皮肤不同，具有负责广泛肤色表型的表皮黑素细胞。

最近，通过插入小鼠大脑的微探针在不同深度测量了穿透大脑和体内更深处的光量，NVOs在这些部位表达。与之前的测量类似，穿透大脑内部的光量对于较长波长更高。在没有毛皮和皮肤的情况下，照射在头骨表面的光，对于405 nm（Opn5的λ_max），0.2%穿透到2 mm深度，~0.03%穿透到4 mm深度。对于480 nm的入射光（Opn3的λ_max），1-2%到达大脑2 mm深度，~0.06%到达4 mm深度。实验上，研究如此低水平光的影响面临着在完全黑暗或低水平红光下保存样本和进行测量的挑战。由于NVOs是GPCRs，它们的激活和信号传导通过测量Ca²⁺或cAMP水平的变化来监测，通常使用需要暴露于激发光的荧光指示剂，这也可能激活视蛋白。这些视蛋白在体内生理暴露的低光照水平提出了一个问题：NVOs如何实现如此高的光敏感性，同时表达水平相对低于视杆细胞中的视紫红质。对于Opn4，其在子宫内暴露于非常低光照水平下的光依赖性活动对眼睛发育至关重要，其敏感性是由于延长的单光子反应，允许细胞整合间隔最多~8秒的单个光子的反应。Opn3和Opn5对体内极低水平光做出反应的机制尚待发现。

3. 非视觉视蛋白信号机制

3.1. Opn3

Opn3序列和拓扑在物种间高度保守，从蚊子到鱼类、鸡和哺乳动物。Opn3在视蛋白中的一个独特特征是其长的C末端，与任何GPCR或其他蛋白质没有同源性，但在物种间保守。Opn3的长C末端如何有助于其功能尚未研究，但多个磷酸化位点的存在表明它可能参与arrestin介导的受体内化。

从河豚（硬骨鱼多组织视蛋白，pufTMT）、蚊子和斑马鱼纯化的Opn3同源物吸收蓝绿光；pufTMT和蚊子Opn3还可以通过Gαi/o发出信号，以光依赖性方式降低cAMP。无法确定变色龙、鸡、小鼠和人类Opn3的光谱灵敏度，并且未测量天然斑马鱼、变色龙、鸡、小鼠或人类Opn3的光依赖性cAMP变化。这引发了一个问题：所有物种的Opn3同源物是否都能吸收光或以光独立方式发挥作用。

Opn3的发现及其在哺乳动物中的表达模式

从小鼠和人类大脑中鉴定出的cDNA与脊椎动物视蛋白家族具有高度同源性，并因其在不同大脑区域的高表达而被命名为脑视蛋白，最显著的是在丘脑中。进一步的研究表明，人类OPN3信使RNA（mRNA）在许多外周组织中表达，包括睾丸、胎盘、视网膜、肝脏、心脏、肺、骨骼肌、胰腺和皮肤，因此获得了泛视蛋白的名称。在缺乏特异性抗体的情况下，产生了Opn3-mCherry敲入小鼠来测试Opn3蛋白是否也存在于所有这些大脑区域和外周组织中。Opn3-mCherry表达证实了mRNA分布，并发现了一些具有丰富Opn3表达的特定新脑区。值得注意的是，在海马体中，Opn3-mCherry的表达比以前报道的更广泛，不仅在神经元中，而且在齿状回的星形胶质细胞群体中也有表达。另一个在Opn3启动子下表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的小鼠模型表明，Opn3表达也受发育调控，并在其他脑区发现，其中许多是感觉回路的一部分。

Opn3光活化

吸收光谱首先在蚊子和斑马鱼Opn3中测量，两者均在485 nm处有吸收峰。为了在这些和后续研究中表达和纯化Opn3以获得吸收光谱，C末端（~50个氨基酸）被截短（Opn3ΔC）。另一项研究纯化了人Opn3ΔC，但未能在可见光范围内检测到吸收峰。在后续研究中，Opn3介导的反应由~470 nm左右的波长引起，但也由紫-紫外A（UVA）范围内的光引起：415 nm和320-400 nm。有趣的是，一些研究发现Opn3在缺乏光刺激的情况下发出信号的证据：Opn3通过其G蛋白介导的组成性活性信号调节激动剂诱发的黑皮质素1和4受体（MC1R和MC4R）。类似的基于组成性活性的光独立功能被描述用于Opn3调节血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）。在所有这些研究中，Opn3被显示与它调节其活性的受体形成分子复合物。

这些结果，加上人类Opn3没有吸收峰的观察，提出了哺乳动物Opn3单独是否足以进行光活化的问题。蚊子Opn3在HEK293细胞中表达并暴露于蓝光后，有效地降低了用生物发光法测量的cAMP浓度，显示了充分性并暗示Gαi/o耦合。在同一组实验中，小鼠或人类Opn3的表达不足以使细胞具有光敏性。相比之下，许多研究表明Opn3在不同组织的光介导反应中是必需的。Opn3是否仅在与其他受体形成异聚复合物的细胞环境中才变得具有光敏性？或者，如果哺乳动物Opn3具有高组成性活性（这一假设有待进一步检验），其光活化可能不会引起下游信使水平的可测量变化，使其光活化难以检测。调和Opn3光敏性将需要更深入地理解介导Opn3信号传导和功能在每个细胞环境中的分子步骤。

Opn3信号传导

Opn3的广泛组织表达，包括可兴奋和不可兴奋细胞，提出了Opn3是否在所有细胞类型中使用相同的信号机制引发细胞反应的问题。已发表的数据确定了Opn3下游的一些常见分子信号步骤，但并非所有研究都如此，然而它在不同组织中的功能却大不相同。

Opn3与哺乳动物视紫红质属于同一家族，视紫红质在视杆细胞中通过激活G蛋白的转导蛋白亚基（Gαt，Gαi/o家族成员）发出信号，以激活磷酸二酯酶（PDE）并降低环磷酸鸟苷（cGMP）浓度，进而导致环核苷酸门控（CNG）通道关闭和膜超极化。大多数研究发现Opn3通过Gαi/o发出信号，与该家族的其他成员相似。第一项研究Opn3信号机制的研究表明，在人类表皮黑素细胞中，Opn3以光独立但Gαi/o依赖的方式作为Gαs偶联的MC1R信号的负调节剂起作用，导致黑色素生成减少。Opn3并不调节这些细胞中的其他Gαs偶联受体，这种特异性至少部分是通过与MC1R形成分子复合物来实现的。Opn3对受体介导的cAMP信号的调节不仅限于黑素细胞；在下丘脑神经元中也有描述，Opn3调节能量稳态的关键调节因子MC4R的活性。在这些神经元中，Opn3直接增强内向整流钾通道7.1（Kir7.1）活性，并负调节MC4R介导的cAMP信号传导，从而促进食物摄入。除了与GPCR形成复合物并调节其活性外，最近发现Opn3还可以调节酪氨酸激酶受体。尽管Opn3不在小鼠内皮细胞中表达，但在人脐静脉内皮细胞中检测到，它与VEGFR2形成复合物以上调其表达和激活，导致血管生成增加。该效应与光刺激无关，并且尽管未测试Gαi/o耦合，但假定由Opn3升高的组成性活性介导。

将人类皮肤细胞（黑素细胞、角质形成细胞或成纤维细胞）暴露于蓝光或UVA光导致Opn3依赖性胞质Ca²⁺增加，在某些情况下由Gαi/o激活介导。在暴露于UVA（320-400 nm，10 J/cm²，相当于~23.15小时暴露于中午赤道阳光）的皮肤成纤维细胞中，Ca²⁺反应导致钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）激活和参与光老化的基质金属蛋白酶表达增加。在与人黑素细胞共培养的人角质形成细胞中，暴露于UVA（320-400 nm，3 J/cm²，相当于~7小时暴露于中午赤道阳光）增加了Ca²⁺水平并激活了CaMKII，导致核黑素体帽的形成，保护角质形成细胞免受太阳紫外线辐射。

将人黑素细胞暴露于蓝光（415 nm，50 J/cm²，相当于~79小时暴露于中午赤道阳光）并在两天后分析，发现黑色素生成酶表达增加和黑色素含量更高，当下调Opn3时该反应减弱。一项后续研究将人黑素细胞暴露于更高波长的蓝光（470-480 nm，每天13.68 J/cm²，持续3天，相当于每天12.7小时暴露于中午赤道阳光，持续3天），并测量了由瞬时受体电位香草素1（TRPV1）离子通道介导的Ca²⁺增加。每天暴露三天后，TRPV1表达增加，细胞具有更高的黑色素含量。Opn3作为蓝光依赖性色素沉着正调节因子的发现似乎与Opn3作为色素沉着的光独立负调节因子的作用相冲突。如果光充当反向激动剂来关闭Opn3的组成性活性，这些相反的结果可以调和。在这种情况下，光暴露将导致Opn3活性降低和通过黑素生成的MC1R/cAMP通路的信号传导增加。

暴露于蓝光导致平滑肌细胞松弛，这一过程在来自Opn3缺失小鼠的气管环中显著减弱。光剂量和暴露时间似乎相当非生理性，但尽管如此，响应光暴露，Opn3通过Gαs发出信号，并且还发现与Gαs相互作用，增加细胞cAMP，并激活蛋白激酶A（PKA）导致松弛，该通路被G蛋白偶联受体激酶2（GRK2）抑制。有趣的是，当Opn1-LW（红光激活的锥状视蛋白）在永生化人气道平滑肌细胞中表达并用红光刺激时，它也能够使用相同的信号机制。同一小组的一项更近期的研究表明，β-紫罗兰酮，一种β-胡萝卜素代谢物，可能与气道平滑肌细胞中Opn3的视黄醛发色团竞争，以激活相同的信号通路并导致松弛。这些是首次显示化学化合物（而非光）可以激活Opn3通路的实验，推测是通过直接激活Opn3。进一步研究光和β-紫罗兰酮刺激气道平滑肌细胞如何激活Gαs信号通路导致松弛，将阐明Opn3被化学化合物激活的机制。

Opn3介导的细胞/组织/生物体反应

两项同时进行的研究表明，Opn3在小鼠和人类脂肪组织中表达，并有助于脂肪细胞脂解和产热能力调节。Nayak等人发现Opn3在年轻小鼠中主要在白色脂肪组织（WAT）中表达，在棕色脂肪组织（BAT）中检测到低水平。具有全局或脂肪细胞特异性Opn3缺失（Adipoq-cre; Opn3^fl/fl）的新生小鼠在全光谱光照下暴露于寒冷时核心体温较低，但当省略蓝光时则不然，这表明蓝光（480 nm）和Opn3都是脂解介导的温度调节所必需的。有趣的是，从Opn3缺陷小鼠分离的培养脂肪细胞表现出类似的脂解缺陷，而单独暴露于蓝光无法挽救。第二项研究发现，Opn3缺失小鼠在高脂肪饮食上比野生型对照增加更多体重，原因是BAT的产热能力降低。来自Opn3缺陷或对照小鼠的培养棕色脂肪细胞在缺乏Opn3或蓝光的情况下脂解减少，在体内也测量到这种效应，使用外部蓝光源激活有或没有Opn3表达的成年小鼠的BAT产热。一项后续研究探索了Opn3在光诱导代谢变化中通过脂肪-下丘脑通路的功能。该研究发现，在植入小鼠皮下的白色脂肪组织中植入一个微型发光二极管（LED）传递蓝光八天，以Opn3依赖性方式改善了与高脂肪饮食相关的代谢异常。WAT中的Opn3激活导致组氨酸在循环中释放，激活了下丘脑中的组胺能神经元。这些神经元反过来激活交感神经系统，从而增强了BAT的产热活性。

这些研究表明Opn3在细胞水平介导脂解。WAT和潜在的BAT中的脂解由β3-肾上腺素能受体（β3AR）（一种Gαs偶联的GPCR）的激活启动，导致cAMP增加、PKA激活和下游靶标的磷酸化，以及cAMP反应元件结合蛋白（CREB）介导的基因转录。在缺乏Opn3或蓝光的情况下，WAT和BAT中的脂肪细胞具有较低的cAMP水平或PKA底物的磷酸化减少，与β3AR信号传导减少一致。这些结果与Opn3直接或间接增强β3AR信号传导的情况一致，可能通过直接相互作用，类似于其与MC1R/MC14R或VEGFR2的相互作用。β3AR是βAR家族中最不同的，可能与Opn3相互作用。然而，在这种情况下，预测为Gαi/o偶联的Opn3之间的潜在相互作用将通过Gαs激活增强β3AR信号传导，与Opn3调节MC1R/MC14R信号传导的效果相反。Gαi/o偶联的受体如何增强Gαs偶联受体仍有待确定。这些研究与Opn3在下丘脑负调节MC4R一起，表明Opn3可能对大脑与外周组织的能量平衡具有相反的影响。

这些研究的另一个共同发现是Opn3在WAT和BAT中推断的组成性活性，在WAT中缺乏蓝光的影响比缺乏Opn3的影响更温和，而在BAT中，即使在缺乏蓝光激活的情况下，Opn3缺失小鼠的脂解也受损。Opn3的组成性活性与其调节β3AR一致，β3AR也已知具有高组成性活性，并且与之前的发现一致。Opn3的组成性活性影响基线cAMP（基因表达的重要调节因子），这也得到了Opn3缺失小鼠脂肪细胞中改变表达的大量转录本的支持。这些发现表明Opn3在脂肪细胞中作为光传感受体发挥作用，以光依赖性方式调节代谢反应。

Opn3在癌症中的潜在功能已通过将Opn3表达和光活化与癌细胞活力、增殖和转移潜力相关联进行了研究。Opn3在正常组织中的广泛分布预测其在转化细胞和肿瘤中同样广泛表达。事实上，在许多类型的肿瘤中发现了Opn3表达，从黑色素瘤到结肠癌、肺腺癌、甲状腺癌和三阴性乳腺癌等。使用了两种类型的方法来研究Opn3在肿瘤中的作用：测量用蓝光或UVA光对OPN3进行光活化的效果，以及将Opn3的表达水平与细胞的增殖、迁移和侵袭特性相关联。有趣的是，大约一半的研究发现Opn3表达和/或光刺激降低了细胞活力和肿瘤生长，而另一半得出了相反的结论。值得注意的是，发现Opn3依赖性生长抑制的研究使用了蓝光刺激，这表明Opn3的光活化可能抑制增殖，而其组成性活性则具有相反的效果。对人类癌症中Opn3预后作用的综合分析发现，在33种癌症类型中的5种，高Opn3表达与不良预后和较低生存率相关。尽管这只是一种相关性，但同一实验室最近的研究表明Opn3是血管生成的正调节因子，可以解释在肿瘤中表达的Opn3如何通过增加血流量导致肿瘤生长。

总之，Opn3是最多功能和多功能的NVO，在多种组织和生理过程中具有预测功能。尽管Opn3的信号机制，特别是通过Gαi/o偶联，已在许多研究中进行了调查，但其激活的细胞环境和所使用的精确通路仍然难以捉摸。Opn3已被证明通过其组成性活性和蓝光或UVA光活化来调节一系列细胞反应，包括产热、黑色素调节和血管生成。对Opn3多样功能的研究、其对光敏感和光独立过程的贡献以及信号通路的阐明，对于理解其更广泛的生物学意义至关重要。

3.2. Opn4

与Opn3的偶然发现不同，Opn4长期以来一直是昼夜节律同步和瞳孔对光反射所寻求的光传感器。最初称为黑视蛋白，Opn4被鉴定为一种在非洲爪蟾真皮色素细胞、大脑和眼睛中表达的新型视蛋白。不久之后，在人类、小鼠和大鼠的内视网膜中鉴定出高度保守的黑视蛋白基因。Opn4的C末端是视蛋白中最长的，与其他GPCR的C末端几乎没有同源性。有趣的是，Opn4 C末端的长度各不相同，并且在进化过程中似乎缩短了：非洲爪蟾的C末端结构域包含213个残基，小鼠156个，人类111个氨基酸，所有这些都明显长于视觉视蛋白平均29个残基的长度。C末端在Opn4信号传导中的功能仍有待研究。

Opn4在哺乳动物中的表达模式

使用针对小鼠和大鼠Opn4的抗体以及在小鼠中在Opn4启动子下表达基因编码荧光蛋白来检测其分布。Opn4在视网膜神经节细胞（RGCs）的一个亚群中表达，赋予它们固有的光敏性（ipRGCs）。对ipRGCs的进一步研究揭示了六种不同的亚型：M1-M6。所有ipRGCs都表达Opn4，但它们具有不同的形态，投射到大脑的不同区域，并介导不同的视觉和非视觉功能。除了ipRGCs，Opn4还在哺